人外周血CD68+单核细胞体外的分选及诱导分化为破骨细胞

目的 建立高纯度人活性破骨细胞方法,用于对破骨细胞生物化学和分子生物学的研究。方法 用免疫磁珠法在人类外周血单核细胞中分选出CD68⁺细胞,用流式细胞仪分析分选效能,体外在10^-8 mol/L地塞米松及25 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的培养条件下用16 μg/L可溶性核因子κB受体活化子配体诱导(s-RANKL)分化,用降钙素受体抗体免疫组化染色及抗酒石酸磷酸酶染色鉴定,扫描电镜观察骨片贴壁细胞及骨吸收陷窝。结果 分选获得CD68⁺单核细胞纯度为(93.06±0.61)%(n=4),经核因子κB受体活化子配体诱导后降钙素受体抗体免疫组化染色阳性,抗酒石酸磷酸酶染色,扫描电镜观察有骨吸收陷窝形成。结论 人外周血单核细胞中CD68⁺细胞是破骨前体细胞,在RANKL在诱导下分化为成熟破骨细胞。     

OPGL诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞及其破骨活性

目的 :观察在小鼠外周血单核细胞培养中破骨细胞抑制因子配基 (osteoprotegerinligand ,OPGL)诱导单核细胞分化为破骨细胞的作用 ,以及地塞米松对破骨细胞分化和骨吸收活性的影响 .方法 :将外周血单核细胞分组培养 ,在A组中加入巨噬细胞集落刺激因子和OPGL ,B组中再加入地塞米松 .多核巨细胞形成后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartratere sistantacidphosphatase,TRAP)及甲苯胺蓝染色 .将象牙骨片上骨吸收面积经计算机图像分析以确定其差异 .结果 :外周血单核细胞培养 7～ 10d ,可以见到大量的多核巨细胞 ,体积巨大 .B组中 ,多核巨细胞出现较A组早 .几乎所有的多核巨细胞表现为TRAP强阳性 ,而多数单核细胞和巨噬细胞为TRAP阴性或弱阳性 .在象牙骨片上有大量的骨吸收陷窝形成 ,A、B两组的骨吸收无明显差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :OPGL可以诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞并具有骨吸收活性 .地塞米松可加速OPGL诱导的破骨细胞分化作用 ,但对于破骨细胞的骨吸收活性无影响     

脐血单核细胞向破骨细胞诱导分化的实验研究

目的　脐血单核细胞向破骨细胞诱导分化的可行性研究。方法　分离脐血中单核细胞经1×10 -8mol/L 1,2 5 (OH) 2 D3 诱导培养,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化、组化染色和吸收陷窝观察技术分析细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistantacidphosphatase ,TRAP)表达和骨吸收活性。结果　脐血单核细胞在1,2 5 (OH) 2 D3 作用下分化加速,表现为长梭形和类圆形细胞的增多、增大,体外诱导培养13d ,有多核TRAP阳性细胞产生,但未表现出骨吸收功能。结论　脐血单核细胞经1,2 5 (OH) 2 D3 体外诱导培养后可表现骨细胞的早期特征。     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

肿瘤坏死因子-α诱导外周血单核细胞分化为破骨细胞

目的:验证肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是否可以直接诱外周血单核细胞(PBMCs)分化为具有骨吸收作用的破骨细胞. 方法:小白鼠PBMCs体外培养中加入TNF-α和白细胞介素-1α(IL-1α)及巨噬细胞克隆集落刺激因子(M-CSF);同时,分别加入细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的拮抗剂RANK:Fc和抗TNF-α中和抗体. 对培养终末细胞作组织化学染色,检测破骨细胞特征性标志物抗酒石酸磷酸酶(TRAP)的表达;并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成为指标检测其生物学活性. 结果:PBMCs体外培养形成大量TRAP阳性的多核细胞(MNCs);象牙磨片上见到虫蚀样骨吸收陷窝,后者的面积对TNF-α呈剂量依赖性. RANK:Fc对此现象无抑制作用,而抗TNF-α中和抗体可完全阻断该现象的发生. 结论:TNF-α能够直接诱导PBMCs分化为具有骨吸收功能的破骨细胞.     

大鼠骨髓单核细胞的快速分离方法及向破骨细胞的诱导分化

目的 建立一种简便高效的体外分离大鼠骨髓单核细胞的方法,观察其体外生长特性,并诱导其分化为破骨细胞。方法无菌条件下分离出SD大鼠的胫骨和股骨,使用环氧树脂管（EP 管）和移液枪头快速分离骨髓组织,再用红细胞裂解液去除红细胞。细胞培养过夜后收集悬浮细胞,加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）继续培养扩增后得到贴壁的骨髓单核细胞。观察骨髓单核细胞生长过程中的形态学特征;通过细胞计数试剂盒法（CCK-8）测绘细胞的生长曲线;用流式细胞仪检测细胞表面CD11b 的表达;在加入M-CSF 和核因子κB受体活化因子配基（RANKL）诱导分化后,用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和降钙素受体（CTR）免疫荧光染色鉴定其是否能分化为成熟破骨细胞。结果通过该方法获得的大鼠骨髓单核细胞培养1 d后基本呈小圆形,杂细胞较少。3 d后细胞数目稍多,两端开始出现触角,5 d后数目增多,细胞呈椭圆形,两端触角明显;细胞的增殖依赖于M-CSF;流式结果显示,通过此方法获得的单核细胞纯度较高;TRAP 染色和CTR 免疫荧光染色结果提示,通过该方法获得的单核细胞可以诱导为成熟破骨细胞。结论通过EP管和移液枪头装置可快速分离 获取单核细胞,获得的细胞表型稳定,适合用于骨代谢疾病的进一步研究。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4^＋T细胞体外增殖的影响

OBJECTIVE: To assess the separation efficiency of magnetic-activated cell sorting in the purification of CD4+ T cells from murine spleen, and observe the effects of koumine on the proliferation of the separated cells. METHODS: CD4+ T cells were isolated from murine spleen by magnetic-activated cell sorting (MiniMACS). Fluorescence-activated cell sortering was employed to determine the purity of CD4+ T cells before and after the separation procedure followed by evaluation of the cell viability using trypan blue staining. Concanavalin A- (ConA, 5 microg/ml) or phytahematoagglutinin (PHA,1 mg/ml)-induced murine T cells were treated with different concentrations of koumine (10-320 microg/ml), and their proliferation was determined by MTT colorimetry, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure IL-2 level in the cell culture supernatant. RESULTS: The purity of CD4+ T cells reached (90.3+/-5.8)% after the purification with a cell viability of (94.9+/-3.6)%. Koumine (20-320 microg/ml) dose-dependently inhibited ConA- or PHA-induced proliferation of murine lymphocytes as compared with the controls (P<0.05). Koumine (20, 100, and 200 microg/ml) significantly decreased the level of IL-2 in comparison with the control group (P<0.05). CONCLUSIONS: CD4+ T cells of high purity can be obtained from murine spleen using MiniMACS without impairing the viability of the cells. Koumine significantly inhibits the proliferation of murine CD4+ T cells due to its immunosuppressive effect and inhibition of IL-2 secretion.     

外周血CD4^＋CD25^＋CD127^-调节性T细胞在过敏性紫癜中的表达及意义

目的 探讨外周血CD4^＋CD25^＋CD127^＋调节性T细胞在HSP患儿治疗前和治疗后的表达及其临床意义。方法选取HSP患儿4l例作为观察组,选取健康儿童41例作为对照组,检测对照组儿童及观察组患儿治疗前后的CD4^＋CD25^＋CD127^＋值。结果（1）治疗前与对照组比较,CD4^＋CD25^＋CD127^＋明显降低（P〈0．05）;（2）与治疗前比较,观察组患儿的CD4^＋CD25^＋CD127^＋值在治疗后明显升高（P〈0．05）;（3）与对照组比较,观察组患儿治疗后CD4^＋CD25^＋CD127^＋值差异无显著性（P〉0．05）。结论外周血CD4^＋CD25^＋CD127^＋值在HSP患儿治疗前显著降低,给予有效的治疗后其值显著升高,可能在HSP的发生发展过程中调节性T细胞进行了参与。而对于HSP患儿对疾病的有效预测．可以对其CD4^＋CD25^＋CD127^＋值进行测定。     

CD147对体外破骨细胞分化成熟的影响

目的建立破骨细胞(osteoclasts,OCs)体外分化成熟的模型,研究CD147对OCs分化成熟的影响。方法从外周血分离单个核细胞贴壁培养,使用破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κβligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)诱导OCs生成。实验分为对照组、诱导组(RANKL+M-CSF)及阻断组(RANKL+M-CSF+CD147Ab),应用免疫荧光染色和流式细胞术检测CD147在破骨前体细胞(osteo-clast precursor cells,OPCs)的表达;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色观察OCs的分化成熟情况及Real-time PCR技术检测CD147及TRAP mRNA在OPCs中的表达变化。结果①CD147分子在OPCs细胞膜上表达。②流式细胞术测得细胞膜表面平均荧光强度对照组(159.55±1.65)、诱导24 h组(171.18±3.46)、诱导48 h组(1...     

钛合金颗粒存在下破骨细胞的体外诱导培养

目的 探讨钛合金颗粒存在下小鼠巨噬细胞体外诱导培养为成熟破骨细胞的方法。方法 获取小鼠骨髓巨噬细胞,采用巨噬细胞集落刺激因子依赖性前体细胞诱导法,于钛合金Ti-6Al-4V颗粒存在条件下进行诱导培养,培养后细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,RT-PCR法检测破骨细胞特异性TRAP、CK、CR mRNA表达;采用相同方法于骨片上诱导培养细胞并观察骨吸收陷窝。结果 Ti-6Al-4V颗粒存在下培养第6天细胞开始出现融合,第9天出现多核巨细胞,TRAP染色阳性,细胞内有破骨细胞特异性TRAP、CK、CR mRNA表达;于骨片上诱导培养的细胞可形成骨吸收陷窝。结论 钛合金颗粒存在下,成功将小鼠骨髓巨噬细胞体外诱导培养为成熟破骨细胞。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血，分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC)，分别用B-巯基乙醇(B—ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6．7％、12．4％和20．8％。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36％，B—ME、DMSO分别为33％和25％。结论脐血MSC具有神经干／祖细胞的特性，在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC),分别用β-巯基乙醇(β-ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6.7%、12.4%和20.8%。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36%,β-ME、DMSO分别为33%和25%。结论 脐血MSC具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法。方法分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2和Flk-1的表达,并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定。结果在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达。PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为(90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P<0.05)。结论外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法。     

外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的体外培养

目的 探讨外周血单个核细胞向平滑肌祖细胞分化的培养方法. 方法 分离人外周血单个核细胞,接种于加有牛垂体提取物的M-199培养基中,第8 天予以血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)刺激促进细胞分化,刺激15 d后运用RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测平滑肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM MHC)、调宁蛋白(Calponin)、CD34、Tie-2 和Flk-1的表达, 并以流式细胞技术检测培养细胞α-SMA阳性表达率,对培养细胞进行鉴定. 结果 在PDGF-BB刺激培养15 d后细胞表达平滑肌细胞的标记α-SMA、SM MHC和Calponin,同时表达干细胞的标记CD34,并发现其Flk-1阳性表达,Tie-2阴性表达.PDGF-BB刺激后细胞α-SMA阳性表达率为 (90.57±5.63)%,与阴性对照细胞之间有统计学差异(P＜0.05). 结论 外周血单个核细胞分离后第8天,使用PDGF-BB刺激可使其向平滑肌前体细胞分化,提出了一种新的外周血单个核细胞向平滑肌细胞分化的培养方法.     

聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞免疫反应的影响

目的 研究聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞免疫反应的影响。方法 采用MTT法测定淋巴细胞增殖反应和IL－2活性,采用免疫细胞化学和间接免疫荧光测定IL－2R的水平,采用和放射免疫法细胞内cAMP浓度。结果 50,150,500μg/mL聚酯型儿茶素对人外周血单核细胞增殖有明显的促进作用,亦可促进经植物血凝素（PHA)在化的人外周血单核细胞产生IL－1及表达IL－2R。此外,聚酯型儿茶素可明显降低人外周血单核细胞内cAMP浓度,也可对抗前列腺素E1（PGE1）升高cAMP的作用。结论 聚酯型儿茶素对人具有明显的免疫增强作用,其机制与促进IL－2的诱发及其受体的表达,降低细胞内cAMP水平有关。     

人巨细胞病毒体外感染对外周血单个核细胞的趋化功能

目的: 探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)体外感染对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的趋化功能,及地塞米松对病毒趋化作用的影响。方法: 将HCMV AD169株稀释成梯度半数组织培养感染量(tissue culture infective dose,TCID50),即5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50,分别感染人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HELF),培养24,48,72,96 h后提取上清液,趋化PBMC,于倒置显微镜高倍镜下观察并计数被趋化的PBMC,比较趋化作用的强弱;同时用不同质量浓度的地塞米松(0.125,1.25,12.5,25,50,100 μg/mL)感染HELF,观察其对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用的影响,0 μg/mL作为对照。结果： 5 TCID50与10 TCID50 之间,80TCID50与1 00 TCID50之间,1 00 TCID50与1 000 TCID50之间,培养24,48,72,96 h时趋化作用差异均无统计学意义(P均>0.05)。10 TCID50与20 TCID50之间,20 TCID50与40 TCID50之间,培养24,48,72 h时趋化作用差异均无统计学意义(P均>0.05)。同一浓度病毒,培养24 h与48 h之间趋化作用差异均无统计学意义(P均>0.05),培养48 h与96 h之间,72 h与96 h之间趋化作用差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组(0μg/mL)比较,1.25 μg/mL和12.5 μg/mL地塞米松对HCMV感染上清介导的PBMC趋化作用无明显影响(P均>0.05),其余质量浓度差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论： HCMV感染HELF后的培养上清具有趋化PBMC的功能,在一定质量浓度范围内,随着时间的延长趋化作用增强。地塞米松体外能够抑制病毒的趋化作用,且对PBMC的趋化抑制作用随着质量浓度的增加而增强。     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

尼古丁对体外培养人外周血单个核细胞分泌TNF的影响

OBJECTIVE: To observe the effect of nicotine on the secretion of TNF of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in vitro, and explore the possible mechanism of the high level of TNF caused by smoking. METHODS: Twenty-one non-smokers and 19 smokers were studied. The PBMCs isolated from each volunteer's blood sample were distributed to three groups, and cultured for 72 hours in supplemented RMPI 1640 alone or in supplemented RPMI 1640 containing 50 ng.ml-1 nicotine or 500 ng.ml-1 nicotine respectively. The level of TNF in supernate was quantified with the immuno-radioassay, and PBMC proliferation was observed. RESULTS: The level of TNF spontaneously secreted by PBMCs in smokers was significantly higher than that in non-smokers (P < 0.05). When the concentrations of nicotine were 50 ng.ml-1 and 500 ng.ml-1, the level of TNF increased significantly in non-smokers (P < 0.05, P < 0.01). In smokers, the level of TNF significantly increased when the concentration of nicotine was 50 ng.ml-1; however, the level of TNF significantly decreased (P < 0.05), and the proliferation of PBMCs was inhibited when the concentration of nicotine was 500 ng.ml-1 (P < 0.05, P < 0.05). The level of TNF was positively correlated to the multiple of PBMC proliferation (r = 0.93, P < 0.05). The linear regression equation was Y = 2.913X - 2.955. CONCLUSION: Nicotine can induce PBMCs to secrete more TNF, and the magnitude of the effect is strongly related to the dosage of nicotine, but a great dose of nicotine will inhibit the production of TNF.