端粒酶催化亚单位和猿猴病毒40大T抗原致人脐静脉内皮细胞永生化

目的用端粒酶催化亚单位(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40大T)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系。方法构建含有hTERT和SV40大TcDNA片段的逆转录病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养。通过细胞免疫组织化学观察、Western blot分析hTERT和SV40大T抗原表达、PCR—ELISA检测端粒酶活性、ELISA分析内皮特异性E-选择素和RT—PCR测定内皮细胞脂肪酶进行细胞形态学和功能学鉴定。结果转染的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形,呈单层铺路石状镶嵌排列。有Ⅷ因子、SV40大T、hTERT表达、E-选择素和内皮细胞脂肪酶表达阳性。转染细胞中端粒酶活性经测定在第12代时为0．36,在第50代时为0．38,而对照的原代细胞在第1代时为1．12,第3代时仅为0．06。结论导入外源性端粒酶催化亚单位和SV40大T抗原能使人脐静脉内皮细胞永生化,保持内皮细胞性状不改变。     

高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老

使用正常糖浓度培养液和高糖培养液处理人脐静脉血管内皮细胞48h后,观察细胞形态,β－半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,PCR—ELISA法检测端粒酶的活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞内活性氧水平。结果发现,与正常糖浓度处理的内皮细胞比较,不同浓度高糖培养液作用48h后的内皮细胞β－半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多,细胞周期多停滞于G0／G1期,S期显著减少,端粒酶活性明显下降,细胞内活性氧水平明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。认为高糖环境可加速内皮细胞衰老进程,其作用机制可能与氧化应激有关。     

十两茶提取物抗氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞衰老机制研究

目的：探讨十两茶提取物对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导衰老细胞模型的影响及其可能的机制。方法将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）株于含有10%牛血清的DMEM培养液中培养,使用ox-LDL孵育建立衰老细胞模型,用β?半乳糖苷酶染色法评价内皮细胞的衰老状态,分别予以不同剂量十两茶提取物及辛伐他汀预处理,检测培养液中活性氧（ROS）、非对称二甲基精氨酸（ADMA）、二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）以及端粒酶活性水平。结果 ox-LDL诱导的内皮细胞衰老模型中β?半乳糖苷酶染色阳性的细胞数量显著增加,细胞内ROS水平、ADMA水平增强,DDAH和端粒酶活性降低,而十两茶提取物预处理可明显抑制这一过程（P＜0.05）。结论十两茶提取物在ox-LDL诱导的内皮细胞衰老进程中起抑制作用,其机制可能与降低细胞内ROS、ADMA水平以及提高DDAH水平和端粒酶活性有关。     

过表达Syndecan-4促进人脐静脉内皮细胞增殖

目的 内皮细胞增殖在血管新生中起着非常重要的作用.本研究拟观察过表达Syndecan-4对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用并对其相关机制进行探讨.方法 分离和培养人脐静脉内皮细胞,分别将过表达Syndecan-4的腺病毒、空病毒转染至人脐静脉内皮细胞,用免疫染色法观察人脐静脉内皮细胞的Syndecan-4的表达水平和自聚现象,用Western blotting方法检测人脐静脉内皮细胞内Akt、内皮细胞氮氧化物合酶蛋白磷酸化的水平;用磷酸化组蛋白3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷法观察人脐静脉内皮细胞的增殖情况.结果 与对照组相比,转染Syndecan-4组的人脐静脉内皮细胞增殖明显活跃,Syndecan-4表达明显增加,且存在自聚现象;Western blotting检测发现,Akt、内皮细胞氮氧化物合酶磷酸化水平较对照组明显升高.结论 过表达人脐静脉内皮细胞Syndecan-4可诱导Syndecan-4自聚,并可能通过活化下游Akt、内皮细胞氮氧化物合酶,促进人脐静脉内皮细胞的增殖.     

血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞衰老的形态学研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老与细胞凋亡的关系。方法制备血管紧张素ⅡRPMI1640培养基培养人脐静脉内皮细胞,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定内皮细胞存活率,β-半乳糖苷酶染色、细胞周期分析鉴定细胞衰老;通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学的变化,透射电子显微镜观察衰老细胞的超微结构。结果血管紧张素Ⅱ诱导组存活的细胞数为对照组的81.9%±0.04%(P<0.01),约80%的细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性染色,流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0-G1,荧光显微镜可见明显的细胞凋亡(P<0.05),透射电子显微镜可见血管紧张素Ⅱ诱导组细胞核染色质浓缩和凝聚。结论血管紧张素Ⅱ可诱导体外培养的内皮细胞衰老,衰老的内皮细胞发生凋亡,提示细胞凋亡参与了血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞衰老的过程。     

二苯乙烯苷对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的影响

目的探讨二苯乙烯苷对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,以过氧化氢作用内皮细胞建立细胞凋亡模型,再加入不同浓度的二苯乙烯苷作用24 h。采用MTT法检测细胞生长活力,Hoechst33258染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR、免疫印迹法检测Caspase-3的表达。结果与空白对照组相比,300μmol/L过氧化氢作用后细胞增殖明显受到抑制,Ho-echst33258染色可见大量凋亡细胞,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Caspase-3的表达量显著增加;加入二苯乙烯苷作用后,与过氧化氢组比较,10μmol/L二苯乙烯苷能够显著提高细胞增殖率,抑制细胞凋亡,并且使Caspase-3的表达减少(P<0.05)。结论二苯乙烯苷能够抑制过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,其作用机制与抑制Caspase-3表达有关。     

人端粒酶逆转录酶RNA干扰对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）RNA干扰对结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响。方法将HCT116细胞分为转染组（转染重组质粒真核表达载体）、对照组（转染空载体质粒）和未转染组。PCR方法检测hTERT干扰序列,RT—PCR方法检测hTERT表达,HE染色、生长曲线和流式细胞术方法分别检测细胞形态、细胞增殖和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色方法检测细胞衰老,Annexin V／PI染色流式细胞光度术检测细胞凋亡。结果转染细胞内均存在hTERT干扰序列,hTERT干扰率为21．5％;与未转染细胞相比,转染细胞核质比明显缩小,增殖率显著下降（P〈0．05）,衰老细胞和G2-M期细胞明显增加（P〈0．05）。hTERT干扰显著增加结肠癌细胞凋亡（P〈0．05）,而对照细胞各指标均无显著变化。结论hTERT干扰显著影响结肠癌细胞的生物学行为。     

内皮型一氧化氮合酶基因启动子区DNA甲基化

目的 探讨内皮型一氧化氮合酶基因启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致内皮细胞损伤中的作用机制.方法 原代培养人脐静脉内皮细胞,加入0、50、100、200、500 μmol/L同型半胱氨酸和100 μmol/L同型半胱氨酸+维生素B12+叶酸的培养液中孵育72 h.MTT法检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性;实时定量PCR测定内皮型一氧化氮合酶mRNA表达;化学比色法测定内皮型一氧化氮合酶活性;硝酸还原酶法检测一氧化氮生成量.巢式降落式甲基化特异性PCR法检测内皮型一氧化氮合酶基因启动子区DNA甲基化改变;同位素法检测DNA甲基化转移酶的活性.结果 人脐静脉内皮细胞与不同浓度同型半胱氨酸孵育72 h后,人脐静脉内皮细胞的增殖活性降低,内皮型一氧化氮合酶mRNA表达、内皮型一氧化氮合酶活性和一氧化氮的含量明显下降.内皮型一氧化氮合酶基因启动子序列DNA甲基化程度随同型半胱氨酸浓度的升高而增加,且DNA甲基化转移酶活性升高,而叶酸和维生素B12有一定拮抗作用,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05和P＜0.01).结论 同型半胱氨酸可导致内皮型一氧化氮合酶基因启动子区序列高甲基化修饰,并出现相应的内皮型一氧化氮合酶基因表达下调,这可能是同型半胱氨酸致内皮细胞损伤的重要机制之一.     

高表达整合素连接激酶促进脐静脉内皮细胞增殖

目的探讨高表达整合素连接激酶对体外培养人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法利用高表达整合素连接激酶的腺病毒转染脐静脉内皮细胞,诱导其在脐静脉内皮细胞中高表达。采用噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测脐静脉内皮细胞增殖能力;Western blot检测脐静脉内皮细胞蛋白激酶B(Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及其蛋白磷酸化水平。结果整合素连接激酶在脐静脉内皮细胞高表达后,噻唑蓝法、流式细胞术、EDU法检测结果均表明:整合素连接激酶病毒转染组细胞增殖能力明显高于空病毒转染对照组(P<0.05或P<0.01)。Western blot检测发现整合素连接激酶病毒转染组蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05),而蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶的表达水平两组间无差异。结论整合素连接激酶能促进脐静脉内皮细胞增殖,其机制可能通过激活下游Akt/eNOS通路。     

激酶非催化的C-叶域蛋白质1对人脐静脉内皮细胞衰老作用的影响及机制

目的:探讨激酶非催化的C-叶域蛋白质1(KNDC1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老作用的分子机制。方法:体外分离培养HUVEC,选择第6代HUVEC转染KNDC1腺病毒为实验组,另设空白对照组与阴性对照组。显微镜下观察细胞形态变化,通过q PCR检测内皮细胞的KNDC1的mRNA的表达,用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况,Westem blot检测衰老相关蛋白,分光光度法检测内皮细胞抗氧化酶活性。结果:第6代的HUVEC呈现出有别于前期传代细胞的衰老特征,细胞变得扁平,体积增大,增殖能力降低;实验组KNDC1的mRNA水平较对照组增高(239%~344%,P<0.05)及蛋白质表达也显著增高(249%~441%,P<0.05),实验组HUVEC的SA-β-gal染色阳性率显著上升(P<0.01),与KNDC1腺病毒转染剂量呈剂量依赖性。实验组磷酸化p53较对照组增加[(244.3±19.5)vs.(113.5±9.0),P<0.05]及抗氧化酶SOD及GPX含量(0.84±0.079);(0.82±0.062)较对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:KNDC1过度表达可能通过启动p53信号通路增加ROS表达,进而加速细胞衰老的进程。     

人端粒相关蛋白HKR3、SMARCB1的筛选及其在胃癌细胞中的表达

端粒酶与肿瘤的发生有十分密切的联系，研究与人端粒酶逆转录酶（hTERT）相互作用的端粒相关蛋白将有助于了解端粒酶在肿瘤细胞中的生物学特性和分子机制。目的：筛选新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶的全酶结构、生物学特性及其作用机制奠定实验基础。方法：采用酵母双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选。构建诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，筛选人睾丸cDNA文库；以蛋白质印迹法测定pGBKT7-hTERT融合蛋白的表达。对筛选得到的阳性克隆质粒进行测序，在GenBank中行同源性比较。采用逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）检测hTERT、HKR3、SMARCBl mRNA在胃癌细胞株SGC．7901中的表达。结果：融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT可在酵母菌株AHl09中有效、稳定地表达。cDNA文库筛选获得GenBank已收录的人cDNA序列HKR3和SMARCBl。hTERT、HKR3、SMARCBl mRNA在胃癌细胞株SGC-7901中表达一致，均呈高表达。结论：HKR3、SMARCBl是人端粒相关蛋白成员．与hTERT有十分密切的联系，可能在胃癌的发生过程中存在相互调节或协同作用。     

人端粒酶催化亚单位锤头状核酶诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染入肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况。 方法 用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核表达质粒pGTRz-U6及其突变体pGTmRz-U6,并以空质粒pEGFP-C1作为对照。Lipofectamine2000转染人肝癌细胞株SMMC7721,G418筛选阳性克隆。RT-PCR检测核酶及hTERT基因的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)作细胞生长曲线观察其生长情况,TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,流式细胞计数(FCM)法检测细胞的凋亡水平。 结果 核酶、突变核酶在SMMC7721中持续表达;凝胶成像系统分析SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT基因表达,用SPSS10.0软件对3种细胞进行分析,发现三者hTERT基因表达水平不同(F=47.987,P<0.01);t检验分析得出SMMC7721-Rz hTERT基因表达明显低于SMMC7721-mRz和SMMC7721- pEGFP-C1(t值分别为-7.640和-11.602,P值均<0.01)。SMMC7721-pEGFP-C1和SMMC7721-mRz hTERT表达没有区别(t=-0.178,P>0.05)。TRAP-银染及FCM结果分别显示,随着细胞的分裂,SMMC7721-Rz和SMMC7721-mRz细胞端粒酶活性逐渐降低,凋亡水平逐渐增加,7PDS细胞凋亡率分别是29.86％和9.87％,而对照组SMMC     

Antisense hTERT inhibits thyroid cancer cell growth

Activation of telomerase represents an early step in carcinogenesis. Increased telomerase expression in malignant thyroid tumors suggests that inactivation of telomerase may represent a potential chemotherapeutic target. The purpose of this study was to inhibit the protein component of telomerase, hTERT, in a human thyroid cancer cell line in vitro and in vivo using an antisense strategy. A 235-bp fragment of hTERT cDNA was subcloned, and sense and antisense hTERT expression vectors were constructed. These vectors were transfected into a human thyroid carcinoma cell line (FRO). Tumorigenic potential was determined by cellular growth assay, rate of apoptosis, anchorage-independent growth, and tumor growth in a nude mouse model. Significant down-regulation of hTERT expression was seen in the antisense transfected cells, compared with control and those transfected with the sense vector. A decrease in telomerase activity by TRAP assay was observed in the antisense hTERT cells but not in cells transfected with the sense hTERT construct. Inhibition of cell growth was observed after approximately 20 population doublings in the antisense-hTERT clones and was associated with an increase in the rate of apoptosis and a change in cellular morphology. Moreover, anchorage-independent growth was reduced in vitro, and tumor growth rate was diminished in vivo in the antisense hTERT clones. Inhibition of telomerase activity with antisense hTERT in human thyroid cancer cells is achievable and may represent a novel target to inhibit tumor growth.     

Telomere and telomerase in the initial stage of immortalization of esophageal epithelial cell

AIM: To search for the biomarker of cellular immortalization, the telomere length, telomerase activity and its subunits in cultured epithelial cells of human fetal esophagus in the process of immortalization. METHODS: The transgenic cell line of human fetal esophageal epithelium (SHEE) was established with E(6)E(7) genes of human papillomavirus (HPV) type 18 in our laboratory. Morphological phenotype of cultured SHEE cells from the 6th to 30th passages, was examined by phase contrast microscopy, the telomere length was assayed by Southern blot method, and the activity of telomerase was analyzed by telomeric repeat amplification protocol (TRAP). Expressions of subunits of telomerase, hTR and hTERT, were assessed by RT-PCR. DNA content in cell cycle was detected by flow cytometry. The cell apoptosis was examined by electron microscopy (EM) and TUNEL label. RESULTS: SHEE cells from the 6th to 10th passages showed cellular proliferation with a good differentiation. From the 12th to the 16th passages, many senescent and apoptotic cells appeared, and the telomere length sharply shortened from 23kb to 17kb without expression of hTERT and telomerase activity. At the 20th passage, SHEE cells overcame the senescence and apoptosis and restored their proliferative activity with expression of telomerase and hTERT at low levels, but the telomere length shortened continuously to the lowest of 3kb. After the 30th passage cells proliferation was restored by increment of cells at S and G2M phase in the cell cycle and telomerase activity expressed at high levels and with maintenance of telomere length. CONCLUSION: At the early stage of SHEE cells, telomeres are shortened without expression of telomerase and hTERT causing cellular senescence and cell death. From the 20th to the 30th passages, the activation of telomerase and maintenance of telomere length show a progressive process for immortalization of esophageal epithelial cells. The expression of telomerase may constitute a biomarker for detection of immortalization of cells.