乏氧条件下紫杉醇对SPCA1肺癌细胞的影响

[目的]探讨乏氧条件下紫杉醇对SPCA1肺癌细胞的影响及其机制。[方法]MTT法检测常氧和乏氧条件下紫杉醇对SPCA1细胞的毒性作用;流式细胞术检测紫杉醇对SPCA1细胞周期和凋亡的影响。采用定量RT-PCR和Western Blotting观察SPCA1细胞乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）、多药耐药基因-1（Mdr-1）mRNA和P-糖蛋白（P-gp）的表达变化。[结果]常氧和乏氧条件下,紫杉醇对SPCA1细胞的IC50分别为8．45μmol／L和18．17μmol／L（P〈0．05）,乏氧时紫杉醇诱导SPCA1细胞凋亡较常氧条件下明显减少（P〈0．05）,但乏氧对细胞周期无明显影响。乏氧能明显增加HIF-1α蛋白表达,但对Mdr-1mRNA和P-gp蛋白表达无明显影响。[结论]乏氧诱导SPCA1细胞对紫杉醇耐药,但Mdr-1可能不是乏氧诱导耐药的主要因素之一,乏氧条件下SPCA1细胞耐药可能还存在其他机制。     

超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡抑制乏氧巨噬细胞HIF-1α表达

目的 探讨超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡对乏氧巨噬细胞HIF-1 α表达的影响.方法 CoCl2化学诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7乏氧模型,将乏氧巨噬细胞分成6组(n=13):对照组、紫杉醇组(6×10-6 mol/L)、超声组(0.5W/cm2,30 s)、携氧微泡组(25μL)、携氧载紫杉醇脂质微泡组(25 μL)和超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡组(25μL;0.5 W/cm2,30 s).MTT测定巨噬细胞活性、RT-PCR和Western blot检测各组干预后HIF-1 α的表达,ELISA试剂盒测定干预后上清液TNF-α和IL-6的含量.结果 CoCl2100 μmol/L作用12 h细胞活性抑制率低于8％,可成功诱导乏氧状态;超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡抑制乏氧巨噬细胞HIF-1α基因和蛋白的表达并抑制TNF-α和IL-6的分泌(P＜0.05).结论 超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡能抑制乏氧巨噬细胞HIF-1α表达,从而改善其乏氧状态.     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210的表达

目的探讨不同浓度CoCl2对人肝癌细胞SMMC-7721乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和miR-210表达的影响以及RNA干扰HIF-1α基因对miR-210表达的影响。方法采用Western blot法检测不同浓度CoCl2培养24 h后SMMC-7721细胞HIF-1α蛋白表达变化,实时定量PCR检测miR-210相对表达量。脂质体介导靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF转染SMMC-7721细胞后,乏氧培养24、48和72 h,分别采用Western blot法和实时定量PCR检测细胞HIF-1α蛋白表达变化和miR-210相对表达量。结果 50和100μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量与0μmol/L组相比,差异均无统计学意义（均P〉0.05）;150和200μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量均显著高于0μmol/L组（P〈0.05或P〈0.01）。转染质粒pGenesil-HIF后乏氧培养24、48和72 h,细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量显著低于阴性干扰组（均P〈0.01）。结论化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210表达明显上调,RNA干扰HIF-1α基因可明显下调乏氧细胞miR-210表达。     

腺病毒介导的靶向自杀基因对卵巢癌耐药细胞株的杀伤作用

目的研究多药耐药基因1（mdr1）调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因（CD∷UPP）联合5-氟胞嘧啶（5-FC）后对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株生长的影响。方法以复制缺陷型重组腺病毒为载体，将mdr1-CD∷UPP基因分别转染2对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol、SKOV3/Taxol及非耐药细胞株A2780和SKOV3，加入含5-FC的培养液培养，5 d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，观察旁观者效应。结果5-FC对转基因耐药细胞的生长抑制作用明显高于转基因的非耐药细胞，随着5-FC浓度增加，抑制作用增强；通过旁观者效应5-FC可杀伤周围未转基因的耐药细胞。结论mdr1-CD∷UPP靶向自杀基因联合5-FC后对紫杉醇耐药细胞具有显著的特异性杀伤作用。     

卵巢癌紫杉醇耐药细胞耐药性和髓样分化因子88关系的研究

目的：研究卵巢癌亲本A2780细胞与卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol生物学特性及与髓样分化因子（Myeloid dif－ferentiation factor 88,MyD88）的关系。方法：应用CCK-8法检测A2780细胞和A2780/Taxol细胞的耐药性和耐药指数,采用流式细胞法检测A2780和A2780/Taxol细胞的细胞周期。应用罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）排出实验测定P-糖蛋白（P-gly－coprotein,P-gp）表达。应用Western blot检测A2780和A2780/Taxol细胞中P-gp的表达情况。应用细胞免疫化学检测A2780和A2780/Taxol细胞中MyD88、P-gp的表达情况。结果：A2780与A2780/Taxol相比,A2780/Taxol生长缓慢,呈G1期阻滞;CCK-8结果显示A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50为（36.81±2.05） μg/ml,A2780细胞对紫杉醇的IC50为（1.40±0.18） μg/ml;两者的耐药指数（Resistance index,RI）为26.35。Rh123排出实验显示A2780/Taxol平均荧光强度显著降低。Western blot检测发现A2780/Taxol的P-gp表达比A2780明显升高（P<0.05）。细胞免疫化学检测发现A2780/Taxol中的P-gp和MyD88表达明显高于A2780细胞。结论：A2780/Taxol细胞株具有明确的耐药性,紫杉醇耐药与MyD88的表达密切相关,该细胞株可用于卵巢癌紫杉醇耐药的基础研究。     

乏氧对肺腺癌A549细胞P糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的影响

目的 通过研究乏氧对人肺腺癌细胞株A549的P糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧在引起肿瘤细胞多药耐药中的作用。方法 乏氧条件下(2％O2)人肺腺癌细胞株A549体外培养24h,丙酮固定后运用免疫组织化学的方法对乏氧诱导因子-1α(HIE-1α)、P-gp和MRP的表达进行检测,并用MTT法检测乏氧条件下A549细胞在阿霉素和顺铂作用下的存活率。结果 乏氧条件下人肺腺癌细胞株A549中乏氧诱导因子-1α、P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白的表达明显较正常氧浓度下增高,HIF-1α与P-gp、MRP的表达增高存在明显的相关性。乏氧条件下人肺腺癌细胞株A549对阿霉素的耐药性明显增强。结论 在人肺腺癌A549细胞中HIF-1α蛋白表达与P-gp和MRP表达存在明显的相关性。     

LRIG1在卵巢浆液性囊腺癌细胞对依托泊苷敏感性中的作用研究

目的  探讨亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因-1（LRIG1）在卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株中对依托泊苷敏感性的可能机制。方法  噻唑蓝比色法（MMT）检测不同浓度VP16干预下48 h的SKOV3细胞组、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞组、SKOV3/VP16细胞组和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的增殖。平板克隆检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LRIG1 mRNA表达。结果  半抑制浓度（IC50）分别为62.90、115.49、156.50和195.42μg/L,siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16的耐药指数分别为1.8、2.5和3.1。SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的克隆率（F =39.338,P =0.000）,细胞的LRIG1 mRNA（F =63.095,P =0.000）和凋亡细胞（F =230.046,P =0.000）明显不同,与SKOV3比较,siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t =0.026、0.0710和0.125,P =0.042、0.000和0.000）,细胞的LRIG1 mRNA降低（t =0.130、0.525和0.825,均P =0.000）,凋亡细胞减少（t = 12.350、35.506和44.412,均P =0.000）,与siRNA LRIG1转染SKOV3比较,SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t =0.044和0.099,P =0.001和0.000）,LRIG1 mRNA降低（t =0.395和0.695,均P =0.000）,凋亡细胞减少（t =23.156和32063,均P <0.05）,与SKOV3/VP16比较,siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加（t =0.055,P =0.000）,细胞的LRIG1 mRNA降低（t =0.300,P =0.000）,凋亡细胞减少（t =8.906,P =0.000）。结论  LRIG1 mRNA影响SKOV3细胞对药物的敏感性,沉默LRIG1的耐药细胞可抑制SKOV3细胞凋亡。

     

乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.     

顺铂联合紫杉醇分次给药抑制卵巢癌细胞SKOV3的种群恢复

目的：比较顺铂（cisplatin,CDDP）与紫杉醇（paclitaxel,PTX）不同的给药方案对卵巢癌细胞种群恢复的影响。方法：（1）CDDP、PTX或CDDP联合PTX分别于第1天（D1）或D1及D8处理卵巢癌SKOV3细胞;（2）倒置显微镜观察不同处理组中,SKOV3细胞凋亡与种群恢复的情况;（3）CCK-8法分别测定不同处理组在D7和D21时SKOV3细胞的吸光度（absorbance,A）值。结果：（1）单用CDDP组中,单次给药组与分次给药组相比较,二者对SKOV3细胞的凋亡与种群恢复的影响无明显差异（P=0.970）;（2）单用PTX组中,与单次给药组相比,分次给药组明显抑制了SKOV3细胞的种群恢复（P=0.000）;（3）CDDP联合PTX组中,分次给药组较单次给药组对SKOV3细胞的种群恢复明显抑制（P=0.000）,并且在分次给药组中,CDDP联合PTX组较单用PTX组明显抑制SKOV3细胞的种群恢复（P=0.000）。结论：CDDP联合PTX分次给药较单次给药可能通过抑制卵巢癌细胞的种群恢复从而抑制卵巢癌的耐药或复发。