过表达INPP4B对人急性髓系白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响及其潜在机制

目的：探讨二型磷脂酰肌醇4磷酸酶（inositol polyphosphate 4-phosphatase type Ⅱ,INPP4B）对人急性髓系白血病THP-1细胞体外增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法：将携带INPP4B的重组质粒载体pEAK-Flag/INPP4B转染人THP-1细胞系（Flag-INPP4B组）,同时设立未处理组为对照（Mock组）。采用qRT-PCR和Western blot分别检测实验组和对照组细胞INPP4B mRNA和蛋白的表达水平;CCK-8实验检测细胞体外增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2（Bcl-2-associated X/B-cell lymphoma-2,Bax/Bcl-2）以及磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）下游信号分子蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/AKT）和血清糖皮质激素调节激酶-3（serum and glucocorticoid regulated kinase-3,SGK3）蛋白的磷酸化水平;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞内PI（3,4）P2和PI（3）P的水平。结果：INPP4B重组质粒载体转染THP-1细胞后,INPP4B的mRNA和蛋白水平均明显上升（mRNA：t=9.724,P=0.000;蛋白：t=19.520,P=0.000）,提示在THP-1细胞中成功过表达INPP4B。与Mock组相比,Flag-INPP4B组细胞体外增殖能力明显增强（F=31.870,P=0.000）。同时,过表达INPP4B可明显降低细胞凋亡率（t=6.999,P=0.002）;使促凋亡蛋白Bax的表达水平下降（t=24.710,P=0.000）、抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平增加（t=6.398,P=0.003）。此外,过表达INPP4B可增强THP-1细胞SGK3蛋白的磷酸化水平（t=10.470,P=0.000）,而对AKT蛋白的磷酸化水平无明显影响（t=0.285,P=0.790）。最后,过表达INPP4B还可明显降低THP-1细胞中PI（3,4）P2的水平（t=4.515,P=0.011）,同时明显升高PI（3）P的水平（t=5.681,P=0.005）。结论：本研究结果表明过表达INPP4B可促进人急性髓系白血病THP-1细胞的体外增殖并抵抗凋亡,其机制可能与INPP4B介导激活PI3K/SGK3信号通路有关,这提示INPP4B可作为急性髓系白血病治疗的一个潜在靶点。     

CD13表达及其与FLT3-ITD、NPM1突变在急性髓系白血病中的研究

目的:探讨72例急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)患者CD13表达及其与FLT3-ITD、NPM1突变同步检测的临床意义,并分析FLT3-ITD、NPM1突变的关系及其与CD13表达水平的相关性。方法:收集72例AML患者病例资料,采用流式细胞仪检测72例AML患者CD13表达,PCR及Sanger测序法检测FLT3-ITD、NPM1突变。结果:72例AML患者中68例CD13表达阳性(68/72,94.44%),经诱导化疗,44例获得完全缓解(44/68,64.71%)。CD13~+与CD13-患者相比,χ~2=2.118,P=0.148,完全缓解率差异无统计学意义(P>0.05)。68例CD13~+的AML患者中,FLT3-ITD~+/NPM1~+双突变患者白细胞计数明显高于其余3组,差异均有统计学意义(P=0.000、P=0.010、P=0.000),而完全缓解率明显低于FLT3-ITD~-/NPM1~+与FLT3-ITD~-/NPM1~-组,差异有统计学意义(χ~2=8.400,P=0.000;χ~2=8.880,P=0.000)。FLT3-ITD~+/NPM1~-患者中位生存期仅为24个月,较FLT3-ITD~-/NPM1~+与FLT3-ITD~-/NPM1~-患者,生存期更短。FLT3-ITD~-/NPM1~+患者的平均年龄、白细胞计数及血红蛋白均高于FLT3-ITD~+/NPM1~-患者(P=0.030;P=0.000;P=0.040),白细胞计数及血红蛋白均高于FLT3-ITD~-/NPM1~-患者(P=0.020;P=0.00),完全缓解为85.71%,明显高于FLT3-ITD~+/NPM1~+和FLT3-ITD~+/NPM1~-患者(χ2=8.40,P=0.000;χ2=13.45,P=0.000),中位生存期为41个月(95%CI=34.4~47.6个月),较FLT3-ITD~+/NPM1~+和FLT3-ITD~+/NPM1~-患者生存期长,提示NPM1突变患者预后良好。结论:68例CD13~+患者中,FLT3-ITD~+/NPM1~+双突变患者具有高白细胞数和低CR率;FLT3-ITD~+/NPM1~-患者生存期短;FLT3-ITD~-/NPM1~+患者诱导缓解率高,FLT3-ITD~+/NPM1~-较低。对于AML患者,提示可以同时分析CD13表达及FLT3-ITD和NPM1突变的情况,为AML的相关治疗提供一个更好的思路。     

正常核型成人AML患者NPM1基因突变及临床特征分析

目的 探讨正常核型成人急性髓细胞白血病(AML)患者核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因突变情况,并分析NPM1突变阳性AML患者的临床特征.方法 采用高分辨熔解曲线(HRM)法检测正常核型成人AML患者NPM1基因突变,结合临床资料分析NPM1突变阳性的临床特征.结果 85例正常核型成人AML中有19例出现NPM1突变,阳性率为22.4％,NPM1突变型患者分别为M2 4例,M4 5例,M5 9例,M6 1例.NPM1突变组女性占52.6％(10/19),NPM1野生型组女性占31.8％(21/66),两组有统计学差异(P＜0.05);NPM1突变组患者外周血白细胞(WBC)为(66.6±59.1)×109/L,血小板(PLT)为(146.4±155.8)×109/L,而NPM1野生型组患者外周血WBC为(44.1 ±40.1)×109/L,PLT为(71.8 ±46.1)×109/L,两组间WBC有统计学差异(t=0.04,P＜0.05),PLT差异无统计学意义;NPM1突变组患者高表达CD33、CD13、CD117,低表达CD34.结论 NPM1突变阳性的正常核型的成人AML在临床、病理以及免疫表型方面具有独特的特质,值得深入研究.     

RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.     

NPM1和FLT3基因突变的正常核型急性髓系白血病病人临床特征及预后分析

目的 了解正常核型急性髓系白血病(AML)病人核仁磷酸蛋白1(NPM1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)基因突变的发生频率,并探讨基因突变伴随的临床特征及对近期预后的影响。方法 收集94例初治的正常核型AML病人(M3除外),行NPM1、FLT3基因突变检测。结果 94例正常核型AML病人,NPM1基因突变阳性率为40.43%;FLT3内部串联重复突变(FLT3-ITD)阳性率为28.72%;NPM1并FLT3-ITD基因突变阳性率为14.89%;FLT3点突变(FLT3-TKD)阳性率为7.45%。与无突变组相比,NPM1+/FLT3-组发病年龄、外周血白细胞和血小板计数、骨髓原始细胞比例均较高,差异有显著性(t=2.048~2.072,P<0.05)。NPM1-/FLT3-ITD+组外周血白细胞计数和骨髓原始细胞比例均较无突变组高(t=2.549、2.784,P<0.05)。NPM1+/FLT3-组1疗程化疗诱导完全缓解率为87.50%,高于无突变组的63.89%(χ2=4.205,P<0.05);NPM1-/FLT3-ITD+组完全缓解率为53.85%,与无突变组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NPM1、FLT3基因突变是正常核型AML病人中常见的分子学异常,此两种基因突变检测对AML病人的个体化治疗及预后评估有重要意义。     

Qsox1在子痫前期胎盘中的表达及其对滋养细胞凋亡和增殖功能的影响

目的：探究静息巯基氧化酶-1（quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1）在子痫前期（preeclampsia,PE）胎盘中的表达情况,QSOX1对滋养细胞的生物学行为的影响,及其参与PE发生的潜在机制。方法：收集2015年11月至2016年12月于重庆医科大学附属第一医院产科住院行选择性剖宫产术的孕妇的胎盘组织,包括正常足月妊娠组（31 例）和PE组（35例）。正常氧条件下,人绒毛外滋养细胞系（human transformed primary extravillous trophoblast cell line,HTR8/SVneo）细胞分为小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）阴性对照组（siControl）和QSOX1特异siRNA干扰组（siQSOX1）,每组6例样本,实验重复3次。缺氧条件下,HTR8/SVneo细胞分为4组,分别为正常氧处理组（0 h）、缺氧6 h处理组（6 h）、缺氧12 h处理组（12 h）和缺氧24 h处理组（24 h）,每组各6例样本,实验重复3次。采用Western blot法检测正常孕妇与PE孕妇胎盘中QSOX1的差异表达以及HTR8/SVneo细胞缺氧处理后QSOX1和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的蛋白表达。利用siRNA技术干扰HTR8/Svneo细胞QSOX1的表达,用Western blot法检测转染细胞活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved caspase）相关蛋白和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达水平。并利用流式细胞术检测转染细胞凋亡,比色法检测转染细胞的增殖情况。结果：QSOX1在PE胎盘中的表达明显高于正常胎盘（0.955±0.285 vs. 3.921±0.960）（P=0.001）。缺氧处理HTR8/SVneo细胞后QSOX1和HIF-1α的表达均明显升高(1.183±0.160 vs. 3.987±0.098;1.051±0.444 vs. 1.912±0.118）（均P=0.000）。下调QSOX1后HTR8/SVneo细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达明显减少（2.940±0.514 vs. 1.075±0.121;9.223±1.230 vs. 1.011±0.019）（P=0.004;P=0.000）,而CyclinD1的蛋白表达增加（1.851±0.972 vs. 4.189±0.399）（P=0.018）。QSOX1干扰后HTR8/SVneo细胞凋亡能力减低[（21.007±2.214）% vs. （10.057±0.388）％]（P=0.001）,增殖能力增加（0.389±0.162 vs. 1.401±0.059）（P=0.020）。结论：QSOX1高表达引起滋养细胞凋亡增加和增殖减少,可能参与PE的发生。     

半胱氨酸蛋白酶-12表达与细胞色素C释放在脊髓压迫性损伤后少突胶质细胞凋亡中的作用

目的：探讨半胱氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）表达与细胞色素C（cytochrome-C,Cyto-C）释放在脊髓压迫性损伤（com－pressed spinal cord injury,CSCI）后少突胶质细胞凋亡中的作用。方法：采用自行设计的方法制作脊髓压迫模型,通过原位细胞凋亡染色于压迫后1、3、7 d检测CSCI后少突胶质细胞凋亡;运用Western blot技术从分子水平分别检测与细胞凋亡有关的Caspase-12和Cyto-C的表达。结果：不同组别凋亡的少突胶质细胞数目不全相同（F=30.946,P=0.000）,LSD-t法两两比较,1、3、7 d模型组凋亡的少突胶质细胞数目均高于正常组（P=0.000）。与对照组、1 d组、3 d组相比,7 d组凋亡的少突胶质细胞数目最多,组间比较,差异有统计学意义（P=0.000）。不同组别Caspase-12和Cyto-C蛋白表达不全相同（F分别等于1 402.646和326.638,P=0.000）,LSD-t法两两比较,1、3、7 d模型组的Caspase-12和Cyto-C蛋白表达均高于正常组（P=0.000）,与对照组、1 d组、3 d组相比,7 d组的Caspase-12和Cyto-C蛋白表达水平均最高,组间比较,差异有统计学意义（P=0.000）。结论：CSCI后出现了少突胶质细胞凋亡,其凋亡机制可能与Caspase-12表达增强及Cyto-C释放共同作用有关。     

Clusterin基因沉默对脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响

目的：研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默簇集蛋白（clusterin,CLU）基因表达对人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响。方法：设计和合成靶向CLU的短发夹RNA（short hairprin RNA,shRNA）序列（CLU shRNA1,CLU shRNA2）,并构建到慢病毒的载体plentilox 3.7,以不针对任何基因的shRNA序列作为对照（对照 shRNA）。包被能成功表达各种shRNA载体的慢病毒。将慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞,Real-time PCR法和Western blot法测定CLU mRNA表达和蛋白质表达水平,证实干扰效果。给予不同放射剂量（2、4、6 Gy）处理后,通过四甲基偶氮唑盐（thiazolyl blue tetrazolium bxomide,MTT）法及流式细胞仪Annexin V/PI法检测脑胶质瘤U87细胞的存活率及凋亡率。Western blot方法筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果：靶向CLU基因的shRNA特异性地抑制了CLU mRNA和蛋白质的表达。MTT实验结果显示实验干扰组细胞在不同放射剂量下的脑胶质瘤实验U87细胞的存活率与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义（4 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.00３;6 Gy时,对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000,对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。流式细胞仪Annexin V/PI法检测结果表明：4 Gy放疗后2个实验组细胞凋亡率均明显增加,最高达（35.54±0.95）%,较对照组高2倍多,差异具有明显统计学意义（对照 shRNA vs. CLU shRNA1：P=0.000;对照 shRNA vs. CLU shRNA2：P=0.000）。Western blot 法发现CLU沉默可以显著上调促凋亡分子Bax蛋白水平。结论：CLU基因沉默可能通过调控Bax蛋白的表达,明显增强脑胶质瘤U87细胞对放射的敏感性,有望成为增加脑胶质瘤放射敏感性的新靶点。     

姜黄素改善N2a/APP695swe细胞线粒体功能和抑制细胞凋亡的作用

目的：观察姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制。方法：实验细胞分为4个组：N2a/APP695组（WT）、N2a/APP695swe组（APP）、溶剂对照组（DMSO,5 μmol/L）、姜黄素组（Curcumin,5 μmol/L）。流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性。结果：流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[（0.05±0.01） vs. （0.18±0.01）,P=0.000;（49.67±4.16） vs. （197.67±8.08）,P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[（1.00±0.03） vs. （0.64±0.03）,P=0.000]。电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态。同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放。Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[（0.62±0.12） vs. （1.39±0.10）,P=0.000;（0.64±0.20） vs. （1.78±0.03）,P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[（0.66±0.04） vs. （2.12±0.06）, P=0.000;（0.58±0.04） vs. （0.93±0.03）, P=0.000]。结论：姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关。     

E盒结合锌指蛋白2对非小细胞肺癌预后的意义及其介导的多药耐药机制

目的探讨E 盒结合锌指蛋白2（ZEB2）对非小细胞肺癌（NSCLC）预后的意义及介导的多药耐药机制。方法选取72例NSCLC患者癌组织及癌旁组织,免疫组织化学染色检测组织ZEB2的表达,分析ZEB2表达与NSCLC 患者临床资料及生存预后的关系。按照转染类型将细胞分为3 组：ZEB2-siRNA 组、ZEB2-NC组和空白对照组（Mock）。采用小干扰RNA（siRNA）技术降低A549 细胞ZEB2 表达,分别采用不同浓度顺铂、紫杉醇处理A549细胞,CCK-8 法检测细胞对化疗药物的敏感性,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率,Western blot检测细胞耐药蛋白P-糖蛋白（P-gp）、肺耐药相关蛋白（LRP）表达。结果ZEB2蛋白在癌组织阳性表达率为77.8%（56/72）,癌旁组织阳性表达率为23.6%（17/72）,ZEB2蛋白在癌组织阳性表达率高于癌旁组织（ P<0.01）。肿瘤直径≥5 cm 组ZEB2 阳性表达率高于肿瘤直径<5 cm 组,Ⅲ、Ⅳ期组ZEB2 阳性表达率高于Ⅰ、Ⅱ组,淋巴结转移组ZEB2 阳性表达率高于无淋巴结转移组,中低分化组ZEB2 阳性表达率高于高分化组,各组间比较差异有统计学意义（P <0.05）。ZEB2 阳性组总生存率和无病生存期低于阴性组（P <0.05）。Mock 组、ZEB2-NC组和ZEB2-siRNA组细胞存活率均随化疗药物浓度增加而降低,其中ZEB2-siRNA组细胞存活率低于ZEB2-NC组（P =0.000）。经Cisplatin、Paclitaxel处理后,与Mock组、ZEB2-NC组比较,ZEB2-siRNA组细胞凋亡率增 加,G0/G1期所占百分率降低,S期所占百分率升高,组间比较差异有统计学意义（P =0.000）。ZEB2-siRNA组P-gp、LRP蛋白表达水平低于Mock组和ZEB2-NC 组（P =0.000）,ZEB2-NC、Mock 组P-gp、LRP蛋白表达比较差异无统计学意义（P >0.05）。结论NSCLC 组织ZEB2 表达上调,抑制ZEB2 可以降低耐药蛋白P-gp、LRP 表达,并逆转肺癌的多药耐药特性。     

在急性髓系白血病患者中探讨CD33的量化水平跟核仁磷酸蛋白和FMS样酪氨酸激酶3基因突变的关系

目的 在初诊的AML病例中通过平均荧光强度(MFI)和抗体结合能力(ABC)研究CD33的量化水平与NPM1和FLT3基因突变的存在或缺失之间的关系.方法 选择常规检查诊断出的64名AML患者,通过流式细胞仪对筛选出的AML患者进行免疫表型分析.结果 64名患者白细胞的CD33表达量集中在69％(范围12％-91％).存在NPM1突变的病例和不存在的相比,CD33的MFI和ABC值有显著的差异(P＜0.05).其中28名NPM1突变的患者MFI中心值为436(范围16～1830),而36名不存在NPM1突变的患者的MFI中心值为215(范围32～986),差异显著(P＜0.05).选择27个病例研究CD33的ABC值,结果显示,10个存在NPM1突变病例的ABC值集中在12 236(范围2 580～18 356),剩余17个没突变病例的ABC值集中在4 205(范围366～16 720)(P＜0.05).此外,在存在NPM1突变的患者中白血病患者的CD33的MFI值与正常人相比明显增高(P＜0.05).相反,不存在NPM1突变的白血病患者与正常人的MFI值之间没有发现差异(P＞0.5).通过对NPM1 +/FLT3+和NPM1+/FLT3-两个患者组的检测发现,两个组的CD33的MFI值(平均456.3 vs536.2,P＞0.5)和ABC值(平均9243.6 vs.10150.2,P＞0.5)无显著差异.结论 携带NPM1突变的AML患者显示出较高的CD33表达强度,这可为AML的一个更好的相关治疗方案提供思路,具有重要的临床意义.     

婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV对前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响

目的：研究婴儿双歧杆菌（bifidobacterium infantis,BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine ki－nase,HSV-TK）/丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）自杀基因系统对PC-3细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响。方法：采用前列腺癌PC-3细胞悬液皮下注射法建立裸鼠前列腺癌模型,并随机分为4组,每组各12例,分别经尾静脉注射BI-pGEX-TK（重组质粒组）、BI-pGEX-5X-1（空质粒组）、BI（空婴儿双歧杆菌组）和生理盐水（生理盐水组）,联合腹腔注射GCV,4周后,称取裸鼠质量及肿瘤质量。TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,real-time PCR、Western blot分别检测各组肿瘤组织中Fas、FAP-1、casepase3和casepase8的mRNA 及蛋白表达水平。结果：重组质粒组荷瘤裸鼠体质量明显高于其余3组（F=12.952,P=0.000）,肿瘤组织质量明显降低（F=7.795,P=0.000）;重组质粒组凋亡指数明显高于其他3组（F=45.895,P=0.000）;重组质粒组Fas mRNA（F=70.077,P=0.000）、casepase3 mRNA（F=70.611,P=0.000）和casepase8 mRNA（F=73.781,P=0.000）的表达明显上调,FAP-1 mRNA（F=46.880,P=0.000）的表达明显下调。重组质粒组Fas蛋白（F=664.116,P=0.000）、casepase3蛋白（F=203.090,P=0.000）和casepase8蛋白（F=654.354,P=0.000）的表达明显上调,FAP-1蛋白（F=318.989,P=0.000）的表达明显下调。结论：婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因系统可能通过影响Fas介导凋亡信号通路,诱导荷瘤裸鼠前列腺癌细胞的凋亡,发挥抑癌作用。     

PCR结合DNA测序技术检测急性白血病FLT3与NPM1基因突变及其临床意义

目的 研究成人急性白血病(AL)患者FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)及核仁磷酸蛋白(NPM1)基因突变发生情况及临床意义.方法 采用PCR结合DNA测序技术分析65例初诊急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞中FLT3及NPM1基因突变发生情况.结果 在59例急性髓系白血病(AML)患者中检测到FLT3-ITD突变阳性10例(16.9%),NPM1突变阳性15例(25.4%),其中3例同时存在FLT3-ITD突变及NPM1基因突变;而在6例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中均未检测到FLT3-ITD突变或NPM1基因突变.两种突变均与初诊时中位WBC数、染色体正常核型比例及伴有特异性融合基因患者比例有相关关系(P＜0.05).FLT3-ITD+AML患者初诊时骨髓原始细胞比例高(P＜0.05),单纯NPM1+AML患者初诊时表现为BPC较高(P＜0.05)、免疫表型CD34阳性患者比例低(P＜0.05);FLT3-ITD突变阳性者化疗后有低缓解率趋势.结论 FLT3-ITD突变和NPM1基因突变是AML患者常见的基因突变类型.对初诊时高白细胞计数、血小板计数不低、骨髓原始细胞比例高、CD34阴性表型和正常核型的AML患者检测FLT3-ITD突变和NPM1突变,有利于临床判断预后和指导治疗.     

线粒体损伤在脂多糖诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）对血管内皮细胞凋亡的影响及线粒体损伤在其中的作用。方法：LPS刺激体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）后,采用CCK-8检测血管内皮细胞存活率,Western blot检测HUVECs细胞内Bax、Bcl-2、细胞色素C（cytochrome C,Cyt C）和Cleaved-caspase 3蛋白的表达,用流式细胞计数检测细胞的凋亡情况,用荧光探针Mitotracker、JC-1、Mito SOX染色检测细胞内线粒体形态及其膜电位的变化,以及线粒体来源活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生水平;用MitoTEMPOL+LPS干预细胞,检测Bax、Bcl-2、Cyt C蛋白表达以及凋亡。结果：LPS浓度依赖性降低细胞存活率（F=99.31,P=0.000）。与对照组相比,LPS可以明显诱导HUVECs细胞凋亡（t=17.184,P=0.000）,并呈浓度依赖性增加Cleaved-caspase 3（F=13.52,P=0.001）、Cyt C（F=21.008,P=0.000）和Bax（F=16.325,P=0.000）蛋白表达,并减少Bcl-2（F=17.287,P=0.000）蛋白的表达。LPS刺激后HUVECs细胞内线粒体发生明显的片段化和颗粒状变、线粒体膜电位下降（F=92.286,P=0.000）,线粒体来源的ROS产生明显增加（t=5.324,P=0.006）。采用线粒体ROS清除剂（MitoTEMPOL）处理,可抑制LPS刺激的HUVECs细胞Bax（F=19.854,P=0.002）和Cyt C（F=11.594,P=0.009）蛋白表达,增加Bcl-2（F=8.077,P=0.020）蛋白表达,同时降低Cleaved-caspase 3（F=15.941,P=0.004）蛋白表达和减少细胞凋亡（F=57.482,P=0.000）。结论：LPS可以诱导HUVECs细胞凋亡和线粒体损伤,损伤线粒体所释放的ROS可能在LPS诱导的血管内皮细胞凋亡的过程中发挥了重要的作用。     

Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响

目的：研究脂肪细胞因子Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响。方法：培养INS-1细胞,分为正常组：用普通培养基培养24h;棕榈酸（palmiticacid,PA）组：以0.5mmol/LPA培养24h;PA+Vaspin组：先加入320ng/mLVaspin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+雷帕霉素（rapamycin）组：先以50nmol/LRapamycin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组：先以1mmol/L3-MA预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h。葡萄糖（3.3mmol/L和16.7mmol/L）刺激胰岛素分泌实验检测各组胰岛素分泌水平,Westernblot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及P62蛋白水平,mRFP-GFP-LC3检测自噬流水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：与正常组相比,PA组INS-1细胞上清液中胰岛素分泌水平在3.3mmol/L葡萄糖和16.7mmol/L葡萄糖刺激下均降低[（1.02±0.08）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.000;（1.15±0.13）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.000）],PA+Vaspin组较PA组升高[（0.76±0.03）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.001;（0.91±0.04）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.011）];与正常组相比,PA组INS-1细胞p-mTOR与mTOR蛋白比值低（2.04±0.14vs.1.19±0.09,P=0.000）,PA+Vaspin组p-mTOR与mTOR蛋白比值较PA组高（1.51±0.05vs.1.19±0.09,P=0.005）;同时,PA组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与正常组相比明显增加（0.81±0.07vs.0.65±0.04,P=0.005;2.35±0.25vs.1.16±0.11,P=0.000）,P62蛋白水平降低（1.04±0.19vs.0.60±0.08,P=0.000）;PA+Vaspin组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平较PA组低（0.58±0.04vs.0.81±0.07,P=0.001;1.95±0.08vs.2.35±0.25,P=0.007）,P62蛋白增加（0.82±0.03vs.0.60±0.08,P=0.032）;PA组自噬溶酶体数量较正常组多（8.33±1.53vs.0.33±0.58,P=0.000）,Vaspin干预后降低（3.67±1.53vs.8.33±1.53,P=0.001）;同时,PA干预INS-1细胞24h后细胞凋亡明显增加（7.91±0.50vs.22.15±2.05,P=0.000）,PA+Vaspin组较PA组细胞凋亡减少（13.23±1.97vs.22.15±2.05,P=0.000）。结论：Vaspin能够改善棕榈酸诱导的INS-1细胞过度自噬和细胞凋亡,改善胰岛β细胞分泌功能。     

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的：探讨尼古丁（nicotine,NIC）诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法：PC-9分成4组：空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果：尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10 μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05 μmol/L最明显（P=0.000）。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[（15.70±1.53）个/高倍视野 vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin mRNA 表达水平明显降低[（0.932±0.100） vs. （0.459±0.024）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],Vimentin mRNA表达水平明显升高[（1.200±0.200） vs. （1.973±0.129）,F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁＋二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μmol/L时有统计学意义。尼古丁＋二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[（17.00±2.00）个/高倍视野vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁＋二甲双胍组上调E-cadherin mRNA[（0.459±0.024） vs. （0.838±0.058）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],下调Vimentin mRNA[（1.973±0.129） vs. （1.467±0.115）,F=20.998,P=0.000,P=0.003）]。结论：尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。     

高分辨熔解曲线分析正常核型成人AML的NPM1基因突变

目的研究急性髓细胞白血病（AML）患者核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因突变检测方法。方法应用PCR结合高分辨熔解曲线分析技术（HRM）和毛细管电泳法（CE）检测正常核型的成人AML样本的NPM1基因突变,并与CE法进行比较分析,结果经克隆测序验证。结果 85例AML样本均得到可供分析的NPM1基因突变检测结果,NPM1基因突变阳性19例,其中15例A型突变,4例B型突变,突变阳性率为22.4%。与CE法比较,二者符合率为100.0%（85/85）,HRM检测的敏感性和特异性均达到100.0%。结论应用HRM技术检测NPM1基因突变快速简便,而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床AML诊断分型、治疗和预后指导。     

初治急性白血病患者CD133的表达与临床特征关系的探讨

目的探讨肿瘤干细胞分化抗原CD133的表达与急性白血病患者临床特征的关系。方法 90例初治急性白血病患者,急性髓细胞白血病(AML)患者60例,急性淋巴细胞白血病(ALL)患者30例,对所有的患者骨髓进行流式细胞术进行免疫分型及检测CD133的表达,同时采用高分辨溶解曲线技术(HRM)和变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测AML患者的FLT3-ITD和NPM1基因突变,所有患者常规进行外周血WBC、Hb和PLT,以及骨髓象的检测,分析AML和ALL的临床特征以及常见的预后指标与CD133表达关系,以及AML患者CD133的表达与FLT3-ITD与NPM1基因突变的关系。结果 AML患者CD133阳性率60%,ALL患者CD133阳性率为40%。CD133阳性表达者,肝脏、脾脏肿大的发生率两组急性白血病均高于阴性表达(P<0.05);而在AML患者,骨痛发生率阳性表达CD133者为77.8%,显著高于阴性表达者(P<0.05)。在AML组患者中,CD133表达与WBC计数呈现正相关(P<0.01)。AML患者NPM1突变型占35%,FLT3-ITD突变型占30%,FLT3-ITD突变组CD133阳性表达率高于FLT3-ITD野生型组(P<0.05);而NPM1基因突变组与野生型组CD133的表达无统计学差异(P>0.05)。结论白血病细胞CD133的表达与急性白血病常见预后指标、以及FLT3-ITD突变密切相关,有可能成为急性白血病预后不良的指标。     

初诊急性髓系白血病患者FLT3-ITD和NPM1基因联合突变与临床特征的关系

目的探讨初发急性髓系白血病（AML）患者中FMS样酪氨酸激酶3-基因内部串联重复（FLT3-ITD）和核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因突变的发生频率,并进一步分析其与患者临床特征的关系。方法收集44例临床初诊为AML的成人患者骨髓标本,通过基因组DNA-PCR技术对FLT3-ITD和NPM1基因突变进行检测。结果44例患者共检测到FLT3-ITD突变10例,检出率22.7%。FLT3-ITD突变阳性的10例患者和无突变者初诊WBC中位数分别为（98.5±22.5）×109/L和（42.9±12.4）×109/L,两者相比具有统计学差异（P＜0.05）。44例患者共检测到NPM1突变14例,检出率31.8%。大部分突变患者,染色体核型正常。结论FLT3-ITD和NPM1基因突变是AML患者中常见的分子生物学异常,对患者的临床和预后有影响。     

姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。