Caspase-8和DR5在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无诱导凋亡作用。大多数神经母细胞瘤细胞株对TRAIL的诱导凋亡作用耐受与其Caspase8表达缺失有关,也与细胞表面TRAIL受体的表达和分布有关。该文主要探讨Caspase8及TRAIL受体DR5的表达在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞株SKNDZ凋亡中的作用及其发生机制。方法：应用RTPCR方法检测IFNγ作用前后SKNDZ细胞Caspase8的表达;应用WesternBlot方法检测化疗药作用前后SKNDZ细胞DR5的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测TRAIL、IFNγ+TRAIL、化疗药+TRAIL及化疗药+IFNγ+TRAIL对SKNDZ细胞生长及凋亡的影响。结果：SKNDZ细胞不表达Caspase8,IFNγ作用后的SKNDZ细胞Caspase8表达明显增加。对照组未检测到DR5蛋白表达,而阿霉素和依托泊苷处理后检测到DR5蛋白表达。表达Caspase8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感,而同时表达Caspase8和DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感。阿霉素/依托泊苷+IFNγ+TRAIL组早期凋亡率为:(17.9±3.6)%、(14.8±3.3)%,与IFNγ+TRAIL组(3.9±1.2)%比较,差异有显著性(F=26.233,P<0.01)。结论：同时表达Caspase8和DR5的SKNDZ细胞恢复了对TRAIL的敏感性,Caspase8和DR5在TRAIL诱导SKNDZ细胞凋亡中起着十分关键的作用。     

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体联合顺铂对人横纹肌肉瘤细胞株凋亡的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白及TRAIL基因和顺铂联合应用对人横纹肌肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡作用，并分析细胞线粒体膜电位和细胞内cFLIPmRNA表达的改变对凋亡的的影响。方法将TRAIL蛋白、TRAIL基因和顺铂作用于培养的人横纹肌肉瘤细胞，通过MTT比色法、流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和线粒体跨膜电位的改变、RT-PCR检测cFLIPmRNA表达，观察和分析TRAIL蛋白及TRAIL基因单独对横纹肌肉瘤细胞的作用及和顺铂联合作用的效果和机制。结果TRAIL基因和100μg／L的TRAIL蛋白对横纹肌肉瘤细胞的生长抑制率分别为52．5％和43．5％，凋亡诱导率为12．95％和10．26％，联合应用顺铂，生长抑制率和凋亡诱导率均显著高于单独应用，FCM分析显示联合应用降低了线粒体跨膜电位，RT—PCR显示cFLIPmRNA表达下降，与联合应用细胞凋亡率增加相一致。结论TRAIL蛋白和TRAIL基因能有效诱导横纹肌肉瘤细胞的凋亡从而抑制横纹肌肉瘤细胞的生长，联合应用顺铂可显著提高疗效。     

IFN-γ增强TRAIL诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的 探讨γ-干扰素（IFN-γ）对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）抑制神经母细胞瘤LAN-1细胞株生长作用的影响,为TRAIL的临床应用提供理论依据。方法 以神经母细胞瘤细胞株LAN-1为对象,采用MTT比色法和流式细胞术研究IFN-γ对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的影响。结果 IFN-γ组、TRAIL 组和IFN-γ72h＋TRAIL组的存活分数分别为（97.12&#177;3.03）%、（83.35&#177;2.95）%、（60.05&#177;4.05）%。IFN-γ组、TRAIL 组、IFN-γ24 h ＋TRAIL组、IFN-γ 48 h＋TRAIL组和IFN-γ 72 h＋TRAIL组的凋亡率分别为（2.26&#177;0.35）%、（3.03&#177;0.68）%、（6.87&#177;0.99）%、（9.80&#177;1.85）%、（15.11&#177;2.57）%。IFN-γ 24 h＋TRAIL组的凋亡率高于IFN-γ组与TRAIL组（P 〈0.05）。随着IFN-γ预处理时间的延长,TRAIL引起LAN-1的凋亡率也明显上升（P〈0.05）。结论 IFN-γ能有效加强TRAIL对LAN-1细胞株的凋亡诱导作用。     

皮肤血管瘤患儿肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及死亡受体的表达与细胞凋亡的关系

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其死亡受体4、5(DR4、DR5)在小儿皮肤血管瘤各阶段的表达及其与细胞凋亡的关系。方法采用免疫组织化学法检测增生期、消退期血管瘤和正常皮肤组织中TRAIL和DR4、DR5蛋白的表达,并采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术(TUNEL法)检测各组织细胞凋亡情况。结果TRAIL、DR4、DR5蛋白的阳性表达率及细胞凋亡指数(AI)在血管瘤消退期明显高于血管瘤增生期和正常皮肤组织(P<0.05)。结论血管瘤的各个阶段均存在细胞凋亡现象,在由增生期转变为消退期的过程中出现细胞凋亡的上调,TRAIL及DR4、DR5参与细胞凋亡的调节,其与血管瘤的自行消退过程有关。     

TRAIL及其受体DR5在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中的表达和意义

目的 研究肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)及其死亡受体5(DR5)在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中病变不同时期的表达及与细胞凋亡的关系.方法 建立病毒性心肌炎小鼠模型,于注射病毒后第7、10、14、21、28天取心肌组织,HE染色做心肌病理积分,TUNEL法检测凋亡细胞百分率,免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌组织中TRAIL和DR5蛋白及mRNA的表达.结果 病毒感染组小鼠和正常对照组小鼠心肌组织中均存在TRAIL和DR5蛋白和mRNA的表达.病毒感染后第14天,病毒感染组小鼠心肌组织中TRAIL蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.05)和第7天病毒感染组(P<0.05),组间比较差异有统计学意义(F=9.17,P<0.01).病毒感染后第10、14、21天,病毒感染组小鼠DR5蛋白表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=13.32,P<0.01).且TRAIL和DR5蛋白的表达与心肌病理积分、心肌细胞凋亡率密切相关(P<0.05).病毒感染组第10天TRAIL mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=10.86,P<0.01).病毒感染组第10、14天DR5 mRNA表达高于同期正常对照组(P<0.01)和第7天病毒感染组(P<0.01),组间比较差异有统计学意义(F=22.75,P<0.01).结论 病毒性心肌炎小鼠发病中期,TRAIL及其受体DR5在心肌组织中出现高表达,且与病理积分、心肌细胞凋亡率成正相关,TRAIL及其受体DR5可能通过调控心肌细胞凋亡参与病毒性心肌炎的病理过程.     

MYCN基因表达抑制促TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的神经母细胞瘤(NB)为小儿常见恶性肿瘤。MYCN基因高扩增NB细胞对TRAIL诱导凋亡多有抵抗。我们以MYCN基因高扩增NB细胞株为研究对象,抑制其MYCN基因的表达,探讨其对TRAIL诱导凋亡有无增强作用。方法构建MYCN siRNA,转染NB细胞株SK-N-BE(2),抑制MYCN基因表达后,Western-blot法检测SK-N-BE(2)细胞Bcl-2、Bcl-xL、Bid、DR4、DR5表达的变化,ELISA法检测细胞凋亡。结果转染MYCN siRNA的SK-N-BE(2)细胞中MY-CN基因表达显著降低(P<0.05)。MYCN基因表达抑制后,SK-N-BE(2)细胞DR5、Bid表达增高(P<0.05),Bcl-2、Bcl-xL表达降低(P<0.05),DR4表达无变化(P>0.05),TRAIL诱导细胞凋亡显著增强(P<0.05)。结论 MYCN基因表达抑制后,可调控Bcl家族中相关蛋白、DR5的表达,促进TRAIL诱导NB细胞凋亡。     

死亡受体4和5在颅咽管瘤中的表达

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的死亡受体(DR)4和DR5在颅咽管瘤细胞中的表达,探讨其临床意义。方法联合采用免疫组织化学和原位杂交方法检测颅咽管瘤28例和正常脑组织25例中DR表达。观察原位杂交前后颅咽管瘤和正常脑组织中DR表达差异性。结果免疫组织化学染色显示,颅咽管瘤28例均大量表达DR4和DR5,而正常脑组织25例中表达DR4 10例(40.0%),表达DR5 8例(32.0%)。颅咽管瘤组织DR蛋白高表达不同于正常脑组织DR蛋白低表达,两者差异有显著性(P<0.01)。原位杂交显示,DR在28例颅咽管瘤组织和大部分正常脑组织中均呈强阳性表达,两者差异无显著性(P>0.05)。结论颅咽管瘤细胞中普遍存在DR高表达,这可能为颅咽管瘤的凋亡诱导治疗提供新靶点。DR蛋白在正常脑组织和颅咽管瘤中的表达差异可能是TRAIL选择性诱导凋亡的机制之一。     

IFNγ联合TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的探讨IENγ（γ干扰素）对TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）诱导神经母细胞瘤细胞株SMS-KCNR（KCNR）细胞凋亡的影响及其发生机制。方法应用RT-PCR方法检测IFNγ作用前后KCNR细胞Caspase8的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪（FCM）检测IFNγ、TRAIL、IFNγ＋TRAIL及IFNγ＋Caspase8抑制剂（zIETD-FMK）＋TRAIL对KCNR细胞生长及凋亡的影响；应用比色法测定Caspase8相对活性。结果KCNR细胞不表达Caspase8，IFNγ作用48h后的KCNR细胞Caspase8表达明显增加；KCNR细胞对TRAIL不敏感，IFNγ诱导表达Caspase8的KCNR细胞对TRAIL敏感；IFNγ＋TRAIL组Caspase8相对活性明显高于TRAIL组及抑制剂组；zIETD-FMK能阻断Caspase8的活化而抑制TRAIL对KCNR细胞的诱导凋亡作用。结论IFNγ通过诱导Caspase8表达而逆转KCNR细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受。     

Smac基因过表达增强肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导神经母细胞瘤细胞凋亡

目的研究Smac基因在肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导的神经母细胞瘤（NB）SK-N-SH细胞凋亡中的增强作用。方法1.利用反转录（RT）-PCR从人胚肾293细胞中扩增人Smac基因全长cDNA,通过TA克隆构建重组T载体pGEM-T/Smac。2.将目的片段从重组T载体上酶切下来,构建真核细胞表达载体pcDNA3.1/Smac,并转染人NB SK-N-SH细胞。用新霉素G418筛选稳定细胞株SK-N-SH/Smac,并用Western blot鉴定Smac基因的过表达。3.用1 000μg/L的TRAIL作用于过表达Smac基因的SK-N-SH/Smac和普通的SK-N-SH细胞24 h。采用流式细胞分析检测细胞凋亡百分率。另设无TRAIL干预的SK-N-SH/Smac及正常SK-N-SH对照组。4.比色法测定各组细胞中caspase-8酶活性。结果1.成功建立稳定过表达Smac基因的NB克隆株SK-N-SH/Smac。2.流式细胞分析显示1 000μg/L的TRAIL作用24 h后,过表达Smac基因的SK-N-SH细胞凋亡百分率显著高于正常对照的SK-N-SH细胞[（44.8&#177;4.71）%vs（23.6&#177;3.05）%P〈0.05]。3.比色法测定显示,同样在1000μg/L的TRAIL作用24 h后,过表达Smac基因的SK-N-SH/Smac细胞中,caspase-8的酶活性显著高于未转染的普通SK-N-SH细胞[（0.743&#177;0.029）vs（0.476&#177;0.031）P〈0.05]。结论转染并过表达Smac基因可增强TRAIL对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的促凋亡作用。     

术前介入治疗对肾母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨介入治疗 (动脉化疗栓塞 )对肾母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法　观察术前介入组 17例和单纯手术组 2 2例肾母细胞瘤标本的分裂指数和凋亡指数的差异 ,细胞凋亡的检测采用DNA转移酶dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)。结果　术前介入组肿瘤细胞平均分裂指数为 0 .4 2± 0 .2 1,明显低于单纯手术组 2 .4 0± 1.0 1(P <0 .0 1) ;术前介入组肿瘤细胞平均凋亡指数为5 0 .6± 4 8.1,明显高于单纯手术组 19.7± 2 .82 (P <0 .0 1)。结论　抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡是肾母细胞瘤术前介入治疗产生疗效的重要机制。     

ROLE OF CASPASE 8 AS A DETERMINANT IN TRAIL SENSITIVITY OF NEUROBLASTOMA CELL LINES

Objective: Resistance of neuroblastoma (NB) cells to tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)-mediated apoptosis is thought to be caused by loss of caspase 8 expression. The aim of this study is to investigate if induction of caspase 8 by γ-interferon (IFNγ) renders NB cells sensitive to TRAIL. Methods: Caspase 8 expression was monitored by RT-PCR and Western blot analysis. The effects of IFNγ, TRAIL, IFNγ + TRAIL, and caspase 8 inhibitor + TRAIL on the growth and apoptosis of NB cells were detected with the methods of reduction rate of Alamar blue assay and flow cytometry. The relative caspase 8 activity was measured with colorimetric assay. Results: An increased expression of caspase 8 mRNA and protein was found after treatment with IFNγ. IFNγ in combination with TRAIL decreased proliferation of NB cell line SH-SY5Y cells. The killing effect of TRAIL on NB cells expressing caspase 8 was depressed by caspase 8 inhibitor. The relative caspase 8 activity of NB cells expressing caspase 8 increased with the prolongation of TRAIL action time. Conclusions: TRAIL induced apoptosis in NB cells expressing caspase 8.     

Caspase-8在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的：应用干扰素(IFNγ)诱导神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）细胞caspase 8的表达并观察其是否可以恢复NB细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的敏感性。方法：应用RT PCR方法检测IFNγ作用前后NB细胞caspase-8 mRNA的表达;应用Alamar Blue法及流式细胞术检测IFNγ、TRAIL、IFNγ+TRAIL、IFNγ+caspase-8抑制剂zIETD-FMK+TRAIL对NB细胞生长及凋亡的影响;应用比色法测定NB细胞caspase-8相对活性。结果：对TRAIL敏感的CHP212细胞表达caspase-8,且经IFNγ处理后caspase-8 表达水平逐步增加;对TRAIL不敏感的SY5Y细胞不表达caspase-8,IFNγ作用后其caspase-8 mRNA表达明显增加。IFNγ与TRAIL联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。CHP212细胞caspase-8相对活性随TRAIL作用时间的延长逐步升高;IFNγ与TRAIL联合作用的SY5Y细胞caspase-8相对活性明显高于未加药物处理的对照组、IFNγ组、TRAIL组及抑制剂组。结论：表达caspase-8的NB细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感,TRAIL诱导NB细胞凋亡过程中伴随caspase-8活性的增加。［中国当代儿科杂志,2010,12(11)：902-907］     

TRAIL/Apo2L ligands induce apoptosis in malignant rhabdoid tumor cell lines

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo2L) is a potent inducer of apoptosis in various cancer cells, whereas normal cells are not sensitive to TRAIL-mediated apoptosis. Four TRAIL/Apo2L receptors (DR4, DR5, DcR1, and DcR2) have been identified. DR4 and DR5 have a death domain, whereas DcR1 and DcR2 are called decoy receptors because of their incomplete or lack of a death domain. Malignant rhabdoid tumor (MRT) is an aggressive neoplasm showing a poor prognosis because of its resistance to chemotherapeutic agents. In this study, we examined whether TRAIL could induce apoptotic cell death in MRT cell lines. We found that although half of the MRT cell lines examined were sensitive to TRAIL/Apo2L, Western blot analysis revealed that the expression of DcR2 was low in TRAIL-sensitive MRT cells. We examined the effect of doxorubicin on the expression levels of TRAIL receptors and its enhancement on the susceptibility of MRT cell lines to TRAIL. Western blot and flow cytometric analyses revealed that doxorubicin significantly increased the expression of DR5, and somewhat up-regulated the expression of DR4 and DcR2. Moreover, doxorubicin, NF-kappaB inhibitor (SN50), and PI3-kinase/Akt inhibitor (wortmannin, LY294002) enhanced the susceptibility of MRT cell lines to TRAIL/Apo2L-induced apoptosis. These results suggest that TRAIL/Apo2L may provide the basis for clinical trials of TRAIL-based treatment to improve the outcome of MRT patients.     

Resistance to TRAIL-induced apoptosis in neuroblastoma cells correlates with a loss of caspase-8 expression

BACKGROUND: Disruption of apoptotic pathways may be involved in tumor formation, regression, and treatment resistance of neuroblastoma (NB). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a potent inducer of apoptosis in cancer cell lines. PROCEDURE: In this study we analyzed the expression and function of TRAIL, its agonistic and antagonistic receptors, and important intracellular signaling elements in 18 NB cell lines. RESULTS: Semiquantitative RT-PCR revealed that TRAIL-R2 and TRAIL-R3 are the main TRAIL-receptors used by NB cells. Sensitivity to TRAIL-induced apoptosis did not correlate with mRNA expression of TRAIL receptors or cFLIP. Surprisingly, caspase-8 and caspase-10 mRNA was detected in only 5 of 18 NB cell lines. Interestingly, only these five NB cell lines were susceptible to TRAIL-induced apoptosis in a time- and dose-dependent manner. CONCLUSIONS: Treatment with 5-aza-2'-deoxycytidine restored mRNA expression of caspase-8 and -10 and TRAIL sensitivity of resistant cell lines, suggesting that gene methylation is involved in caspase inactivation. Since many cytotoxic drugs induce caspase-dependent apoptosis, failure to express caspase-8 and/or caspase-10 might be an important mechanism of resistance to chemotherapy in NB.     

Loss of caspase-8 expression in neuroblastoma is related to malignancy and resistance to TRAIL-induced apoptosis

Background and Procedures NB-derived cell lines were tested for their sensitivity to apoptosis induced by the tumor-selective apoptotic ligand TRAIL. Noninvasive S-type cell lines are highly sensitive to TRAIL, whereas invasive N-type cell lines are resistant. RESULTS: Although both S- and N-type cell lines express TRAIL-R2, FADD, and caspases-3 and -10, only S-type cells express caspase-8. Reduced levels of caspase-8 protein were also observed in a stage IV NB tumor when compared to a ganglioneuroma. The caspase-8 gene is not deleted in either N-type NB cell lines or high-stage tumors, and expression can be induced by demethylation. CONCLUSIONS: Therefore, caspase-8 expression is silenced in malignant NB, which correlates to tumor severity and resistance to TRAIL-induced apoptosis.     

TRAIL蛋白联合顺铂抑制裸鼠横纹肌肉瘤生长的实验研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白及联合顺铂对RD人横纹肌肉瘤裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的作用机制.方法 将RD人横纹肌肉瘤细胞制成细胞悬液后接种于裸鼠皮下,成瘤后将裸鼠随机分4组:生理盐水组、TRAIL组、顺铂组及两药联合组.检测裸鼠的重量和体积;测定裸鼠肝功能、尿素氮及肌酐;另取肝肾组织进行切片,HE染色观察;用FCM方法检测肿瘤组织Fas表达;用RT-PCR检测DR4和DR5mRNA的表达.结果 各组裸鼠实验前后的体重变化无明显差异;DDP组和TRAIL+DDP组裸鼠的血清丙氨酸转氨酶高于生理盐水组,DDP组与TRAIL+DDP组裸鼠尿素氮和肌酐值比较,无明显差异;TRAIL组、DDP组和TRAIL+DDP组移植瘤的重量均明显降低;各组肝肾组织切片观察未见明显改变;TRAIL+DDP组Fas表达水平高于DDP组和TRAIL组;DDP组和TRAIL+DDP组裸鼠移植瘤细胞的DR5mRNA、DR4mRNA表达水平明显升高,而TRAIL组没有明显改变.结论 TRAIL和顺铂对裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,联用有协同作用.     

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目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人神经母细胞瘤的作用及干扰素-γ(IFN-γ)对新型凋亡分子TRAIL抗瘤活性的影响,并探讨其影响机制。方法应用MTT分析和流式细胞仪研究TRAIL对人神经母细胞瘤细胞的抑制作用及IFN-γ对TRAIL抗瘤活性的影响。用RT-PCR方法检测IFN-γ作用48h后,Caspase-8-mRNA的表达。结果TRAIL(10,50,100μg/L)单独作用、IFN-γ(1000U/mL)单独作用后,对SY5Y细胞的增殖抑制率分别为(4·38±0·89)%、(3·54±1·66)%、(5·03±1·26)%、(5·33±2·06)%;凋亡率分別为(5·18±3·33)%、(5·26±3·64)%、(5·00±2·88)%、(8·14±7·35)%。IFN-γ(1000U/mL)与TRAIL(100μg/L)联合作用后,对SY5Y细胞的增殖抑制率为(41·22±7·09)%;凋亡率为(21·29±6·20)%。RT-PCR方法发现IFN-γ作用48h后Caspase-8-mRNA的表达明显上调。结论神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对TRAIL不敏感,IFN-γ可以明显提高TRAIL对神经母细胞瘤细胞的敏感性,其发生机制可能是通过IFN-γ上调Caspase-8-mRNA的表达而实现的。