大鼠脾脏来源树突状细胞的分离培养及生物学特性

目的 建立从大鼠脾脏中分离单个核细胞并诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法,并分析其生物学特性. 方法 采用胶原酶消化并裂解红细胞获得脾细胞悬液,密度梯度离心获得单个核细胞,单次贴壁法去除淋巴细胞.在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4的培养基中培养诱导DC,获得贴壁细胞群和悬浮细胞群.应用流式细胞仪测定OX62、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达. 结果 大鼠脾脏来源DC在体外培养7～8 d后OX62表达率达到高峰.在贴壁细胞中出现OX62的高表达,而CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达与悬浮细胞无统计学差异(P＞0.05). 结论 脾脏来源的单个核细胞经过7～8 d的培养,在贴壁细胞群中可收获大量DC,且贴壁DC更为幼稚.     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定。方法根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7d和14d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况。结果新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形,胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低。诱导分化7d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则;MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低。诱导分化14d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态;MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0%~86.2%。结论密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法。     

大鼠脾脏树突状细胞的体外分离培养

目的 建立大鼠脾脏树突状细胞(DCs)的体外分离和培养方法,并进行相关鉴定.方法 根据DC低密度和短暂黏附的特点,用梯度密度离心方法分离出大鼠脾脏DC前体和单核细胞,在加入30 ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DMEM培养基中,分别培养7 d和14 d后收集细胞,流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62、CD80、CD86和主要组织相容性复合物-Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的表达情况.结果 新鲜分离的大鼠脾脏DCs细胞呈圆形, 胞体小,在培养液中悬浮生长;表面抗原表达很低.诱导分化7 d时,部分细胞体积增大且形态不规则,表面呈毛刺样,细胞核大而不规则; MHC-Ⅱ分子呈较高水平表达,CD80、CD86表达较低.诱导分化14 d时,大部分细胞呈现典型的树突状细胞的形态; MHC-Ⅱ分子呈高表达,CD80、CD86表达增加,OX62表达阳性率为25.0% ～86.2%.结论 密度梯度离心结合较低浓度GM-CSF+IL-4培养,是大鼠脾脏DCs体外分离和培养的简单、经济且有效的方法.     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83 HLA-DR 及CD80 CD86 。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

不同浓度γ干扰素诱导大鼠脾脏来源树突状细胞表达IDO的变化及对T淋巴细胞增殖的影响

背景：DC可通过产生吲哚胺-2 ,3-双加氧酶（IDO）,抑制T淋巴细胞增殖诱导免疫耐受。因此,上调DC细胞的IDO表达可能成为诱导移植后免疫耐受的新策略。本研究的目的在于探讨不同浓度γ干扰素（IFN-γ）作用下大鼠脾脏来源的树突状细胞（DC）中吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）mRNA和蛋白表达的变化及IDO对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。方法：应用细胞因子体外诱导培养大鼠脾脏来源DC,应用流式细胞仪测定大鼠DC特异性分子OX62和表面分子CD80、CD86的表达。分别用不同浓度（0、100、300、500U/ml）的IFN-γ诱导作用DC后,Real-time PCR测定DC中IDO mRNA的相对表达水平,Western Blot检测DC中IDO蛋白在DC中的表达水平。同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）检测不同浓度IFN-γ诱导后的DC对同种异体T淋巴细胞增殖的影响。结果：体外诱导培养的DC光学显微镜下观察,具有典型的树枝状突起。OX62表达率达到80%以上,CD80、CD86的阳性表达也在80%左右;DC的IDO mRNA和蛋白的相对表达量随着IFN-γ作用浓度的增大逐渐增大,不同浓度组间差异有统计学意义（P<0.05）;各组IFN-γ作用后DC与对照组比较,T淋巴细胞的增殖率显著降低（P<0.05）;且随着IFN-γ作用浓度的增大T淋巴细胞的增殖率逐渐降低,各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：采用改良的培养黏附法体外成功地获得了纯度较高的大鼠脾脏来源的DC;IFN-γ可以诱导大鼠脾脏来源DC表面活性IDO的表达增加,减弱脾脏DC对同种T细胞增殖的刺激能力。     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

大鼠OX-62+树突状细胞的体外诱导及生物学特性

目的 :从大鼠骨髓中有效地诱导、培养OX 6 2 + 树突状细胞 (dendriticcells,DC) ,观察其表型及功能特征。方法 :大鼠骨髓细胞培养 3h ,贴壁细胞加入含重组大鼠GM CSF和IL 4 ,继续培养 6～ 12d ,淘洗法去非粘附细胞中的Fc受体阳性细胞 ,流式细胞仪分析细胞表型及抗原摄取能力 ,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力 ,ELISA测定分泌IL 12水平。结果 :培养DC90 %以上表达OX 6 2。培养 6d的OX 6 2 + DCs具有不成熟表型 ,表达中等水平的MHCII抗原和低水平的CD80、CD86、ICAM 1;分泌少量IL 12 ;具有较强的摄取抗原能力 ,但刺激同种T细胞增殖能力极低。培养 12d的OX 6 2 + DC已经成熟 ,MHCII、CD8、CD86、ICAM 1表达明显增加 ;分泌IL 12增加 ;摄取抗原能力下降 ;刺激同种T细胞增殖能力明显增强。结论 :成功建立了体外大量扩增大鼠骨髓OX 6 2 + DC的新方法。     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells, DC)分享、培养、鉴定的方法.方法 重组大鼠rGM-CSF、 rIL-4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs, DCs经形态学观察、表型检测、功能学鉴定.结果 大鼠骨髓来源的DC在体外9d后完全成熟,90%以上培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62,高表达MHCII、 CD80、 CD86成熟的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 成功地建立了体外大鼠骨髓DC扩增的方法.     

大鼠脾脏内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的 研究大鼠脾脏内皮祖细胞(EPC)的体外分离、定向培养及鉴定方法.方法 用密度梯度离心法获取大鼠脾脏中单个核细胞,用含血管内皮生长因子的DMEM培养液培养,每4天更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化.结果 培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7 d后细胞呈集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列.细胞免疫组化显示,培养7 d细胞CD31表达阳性,细胞DiI-LDL摄取和FITC-Lectin结合双阳性,流式细胞仪检测细胞CD133及VEGFR2的阳性率分别为(53.2±3.5)%和(64.5±5.1)%.结论 密度梯度离心法联合贴壁筛选及血管内皮生长因子诱导分化可以获得大鼠脾脏EPC.