牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响

牙龈卟啉单胞菌分泌的牙龈蛋白作为牙周病的一种重要的毒力因子,一方面通过降解骨保护蛋白（OPG）及促进核因子-κB（NF-κB）受体活化因子配体（RANKL）的释放激活OPG/RANKL/NF-κB受体活化因子信号转导通路,进而诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化,增强破骨细胞功能;另一方面,牙龈蛋白可通过线粒体依赖性内在程序性细胞死亡通路和肿瘤坏死因子受体家族介导的外在程序性细胞死亡通路诱导成骨细胞程序性细胞死亡,抑制成骨细胞功能,最终导致牙槽骨丧失。本文就近年来牙龈蛋白及其对破骨和成骨细胞功能的影响相关研究进展作一综述。     

抗牙龈素粘附片段Hgp44卵黄抗体对实验性牙周炎的抑制作用

目的: 观察抗牙龈素粘附片段Hgp44卵黄抗体(抗Hgp44-IgY)对大鼠实验性牙周炎的抑制作用。方法: 24只雄性SD大鼠随机分为4组:空白组(A),生理盐水孵育组(B),抗Hgp44-IgY孵育组(C)和西吡氯铵孵育组(D)。采用细线结扎大鼠4颗第一磨牙,分别接种经处理的牙龈卟啉单胞菌,辅以蔗糖饮水。4周后检测大鼠牙龈指数(GI),龈下菌斑的BANA试验。处死大鼠后检测牙槽骨丧失量(ABL),牙龈的HE染色,利用qRT-PCR检测牙龈中IL-10、OPG和RANKL mRNA相对表达水平以及OPG/RANKL比率。结果: C组和D组与B组相比,GI、ABL以及BANA结果均显著降低(P<0.01),牙龈组织中IL-10和OPG的mRNA表达水平均显著增高(P<0.01),RANKL mRNA的表达水平显著下降(P<0.05),OPG/RANKL比率显著增高(P<0.001),C组与D组相比,GI、ABL、BANA、IL-10,OPG mRNA水平和OPG/RANKL比率无统计学意义,OPG mRNA 表达水平显著降低(P<0.05)。结论: 抗Hgp44-IgY能减少牙槽骨的吸收,减缓大鼠实验性牙周炎的发展进程。     

淫羊藿苷抑制牙龈卟啉单胞菌超声提取物对人牙周膜细胞增殖及骨保护素表达的影响

目的 探讨不同浓度淫羊藿苷抑制牙龈卟啉单胞菌超声提取物对人牙周膜细胞增殖及骨保护素（OPG）表达的影响.方法 体外培养人牙周膜细胞,用四唑盐（MTT）法检测不同浓度淫羊藿苷（0、0.001、0.01、0.1、1 μg/ml）及50μg/ml牙龈卟啉单胞菌超声提取物,不同时间（24、48、72h）作用下人牙周膜细胞的增殖水平.用RT-PCR及Western blot检测48h人牙周膜细胞骨保护素mRNA和蛋白的表达.结果 淫羊藿苷从0.01～1μg/ml对人牙周膜细胞增殖及骨保护素mRNA和蛋白的表达有促进作用（P＜0.01）,浓度为0.1μg/ml作用最显著.结论 淫羊藿苷可抑制牙龈卟啉单胞菌超声提取物对人牙周膜细胞增殖及骨保护素mRNA和蛋白表达的影响,促进人牙周膜细胞增殖及骨保护素mRNA和蛋白表达.     

牙髓卟啉单胞菌诱导成骨细胞表达RANKL mRNA 的研究

目的：研究牙髓卟啉单胞菌（porphyromonas endodontalis, Pe）ATCC 35406对成骨细胞表达细胞核因子kappaB受体活化因子配基 （receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand,RANKL） 的影响, 探讨该菌诱导牙槽骨吸收的病理机制. 方法：采用原代培养的大鼠头盖骨细胞,分别以10^7、10^9 CFU/ml的Pe感染细胞24 h,为了观察细菌毒性作用的动力学变化,以10^7 CFU/ml的Pe作用细胞 0、 6、12、18 及24 h,逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测RANKL mRNA 的表达. 结果：以10^7和10^9 CFU/ml Pe作用成骨细胞24 h后,细胞表达RANKL mRNA与βactin的mRNA灰度值的比值分别为1.73、2.44.大鼠头盖骨细胞基础表达 RANKL mRNA为0.32.以10^7 CFU/ml Pe感染细胞, 随着感染时间的增加, 细胞 RANKL mRNA 表达逐渐增强为 0.93、2.01、 1.97 、1.73.结论：Pe通过刺激成骨细胞 RANKL的表达, 激活OPG/RANKL/RANK（骨保护因子osterprotegerin OPG,细胞核因子kB受体活化因子receptor activator of nuclear factor-kappaB,RANK）传导系统, 能够诱导牙槽骨吸收,并且其作用具有密度依赖性和时间依赖性.     

牙龈卟啉单胞菌膜泡对牙龈上皮细胞MMPs基因表达的影响

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌膜泡对牙龈上皮细胞基质金属蛋白酶(MMPs)基因表达的影响,揭示牙龈卟啉单胞菌在牙周炎中的致病作用.方法:以Real-time RT-PCR法检测牙龈卟啉单胞菌膜泡刺激下牙龈上皮细胞MMP-1和MMP-3的mRNA表达水平.结果:牙龈卟啉单胞菌膜泡显著地上调MMP-1和MMP-3 mRNA表达水平.结论:牙龈卟啉单胞菌诱导牙龈上皮细胞发生细胞炎症反应,可能是牙周炎发生、发展的重要因素.     

中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞RANKL／OPG表达的影响

目的：探讨中间普氏菌培养上清对牙龈成纤维细胞核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的影响。方法：将系列浓度的中间普氏菌培养上清作用于牙龈成纤维细胞,显微镜下观察细胞的变化。实时定量 RT-PCR法和 Western blot法分别检测 RANKL、OPG mRNA及蛋白水平的表达,并计算 RANKL/OPG的比值。结果：牙龈成纤维细胞的数量随中间普氏菌培养上清浓度的增加而减少,50μg/mL 时,显微镜下没有活细胞存在。在mRNA水平上和蛋白水平上,RANKL/OPG的比值在12．5μg/mL处理组均高于对照组,差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论：中间普氏菌培养上清可诱导人牙龈成纤维细胞表达 RANKL 和 OPG,破坏 RANKL/OPG比例的平衡,影响破骨细胞分化的细胞因子微环境,在破骨细胞分化和牙周炎骨吸收中起着一定的调节作用。     

降钙素基因相关肽对兔成骨细胞OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的：探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及其饵受体骨保护素(OPG)基因表达的影响，了解CGRP在破骨细胞性骨吸收调节中的作用机制。方法：将体外培养的兔成骨细胞用不同浓度的CGRP处理24h，通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来观察成骨细胞两种目的基因(OPG，RANKL)的mRNA表达强度变化。结果：CGRP呈剂量依赖性的刺激成骨细胞OPG mRNA表达，同时亦下调RANKL mRNA表达。结论：CGRP通过调节成骨细胞OPG／RANKL的比值可间接地调节破骨细胞活性，从而影响骨代谢。     

LPS刺激单核巨噬细胞培养上清对成骨细胞OPG/RANKL的影响

目的观察经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清对小鼠成骨细胞MC3T3-E1 OPG/RANKL表达的影响。方法收集经100 ng/mL Pg-LPS刺激的单核巨噬细胞RAW264.7培养24 h后的上清,以不同稀释浓度（10%、20%、30%、40%和50%）的培养上清作用于MC3T3-E1 24h,分别通过RT-PCR、免疫印迹法(Western blotting)检测细胞OPG/RANKL基因和蛋白水平表达的变化,采用SPSS17.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果MC3T3-E1经不同稀释浓度的培养上清刺激后,其OPGmRNA及蛋白表达随浓度的增加而显著减少(P<0.05),而RANKLmRNA及蛋白表达随浓度的增加显著增加(P<0.05)。结论Pg-LPS刺激的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养上清可通过抑制成骨细胞OPGmRNA及蛋白的表达,增加RANKLmRNA及蛋白的表达而抑制其成骨能力,且与浓度呈一定的正相关。     

牙龈卟啉单胞菌诱导的耐受对小鼠牙槽骨吸收的影响

目的:研究牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)诱导的耐受对小鼠骨吸收相关因子白细胞介素-1β(IL-1β)、骨保护素(OPG)/NF-κB受体激活蛋白配体(RANKL)表达水平,以及牙槽骨吸收的影响。方法:采用1×10~9CFU P.gingivalis口内涂布给菌5 d,磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱后,再次口内涂布P.gingivalis给菌2 d,构建Balb/c小鼠牙周组织耐受模型。10 d后收集新鲜牙龈组织,采用western bolt检测牙龈组织中IL-1β、OPG和RANKL表达水平的变化。6周后,收集上颌骨,采用亚甲基蓝染色法检测牙槽骨吸收水平的改变。结果:耐受组小鼠牙龈组织中IL-1β表达水平较非耐受组降低,OPG/RANKL比值较非耐受组升高。亚甲基蓝染色结果显示,耐受组小鼠釉牙骨质界至牙槽嵴顶(ABC-CEJ)的距离小于非耐受组(P<0.01),说明耐受组小鼠牙槽骨吸收较非耐受组降低。结论:P.gingivalis诱导小鼠牙周组织耐受后,小鼠牙龈组织中骨吸收相关因子IL-1β分泌降低,OPG/RANKL比值升高,抑制了牙槽骨吸收。     

白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）表达核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）的影响;并进一步研究IL-22是否与牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）具有协同刺激作用。 方法酶消化法结合组织块法原代培养hPDLF,免疫细胞化学染色法鉴定其来源;取第3~ 5代细胞给予不同浓度（0、5、10、25、50、100 ng/mL）IL-22刺激,培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞毒性实验;采用5、10、25 ng/mL IL-22作用于hPDLF 72 h,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测RANKL、OPG mRNA的表达;随后选择最佳刺激浓度10 ng/mL IL-22,与1 μg/mL Pg-LPS分别或协同刺激hPDLF 72 h,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RANKL、OPG mRNA和蛋白水平的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。 结果50、100 ng/mL IL-22刺激hPDLF后,细胞活力明显下降（F_{24 h}= 15.17,F_{48 h}= 76.37,F_{72 h}= 24.409,P<0.05）;5、10、25 ng/mL IL-22均可上调hPDLF RANKL mRNA表达（F= 32.88,P<0.05）,但是对OPG mRNA表达无明显影响（F= 0.719,P= 0.555）;10 ng/mL组和25 ng/mL组上调RANKL mRNA表达较5 ng/mL组显著（P<0.05）;1 μg/mL Pg-LPS亦可显著上调hPDLF RANKL mRNA和蛋白水平的表达;而10 ng/mL IL-22与1 μg/mL Pg-LPS协同作用下RANKL mRNA和蛋白表达可进一步显著上调（F_mRNA= 36.67,F_蛋白= 41.24,P<0.05）,但是对OPG的表达无明显影响（F_mRNA= 0.652,P= 0.593;F_蛋白= 1.271,P= 0.313）。 结论IL-22可通过影响hPDLF表达RANKL/OPG参与牙周炎骨破坏,并且与Pg-LPS具有协同作用。     

Prostaglandin E(2) is a main mediator in receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand-dependent osteoclastogenesis induced by Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Treponema socranskii

BACKGROUND: Periodontitis is an inflammatory disease that often leads to destruction of alveolar bone; a number of bacteria in subgingival plaque are associated with bone destruction in periodontitis. To understand the mechanism of how periodontopathogens induce osteoclastogenesis, we determined which mediators are involved in the osteoclastogenesis. METHODS: We investigated effects of sonicates from three periodontopathic bacteria, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Treponema socranskii, on osteoclast formation in a co-culture system of mouse calvaria-derived osteoblasts and bone marrow cells. The osteoclast formation was determined by tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining. The expression of the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL), prostaglandin E(2) (PGE(2)) and osteoprotegerin (OPG) in mouse calvaria-derived osteoblasts was determined by immunoassay. RESULTS: Each bacterial sonicate induced the osteoclast formation in the co-culture system. These bacterial sonicates increased the expression of RANKL and PGE(2), and decreased the expression of OPG in osteoblasts. The addition of OPG, an inhibitor of RANKL, in the co-culture completely suppressed the osteoclastogenesis that was stimulated by each bacterial sonicate. Indomethacin, which is an inhibitor of PGE(2) synthesis, reduced more than 88% of the osteoclast formation induced by each bacterial sonicate. Indomethacin inhibited more than 80% of RANKL expression in osteoblasts induced by T. denticola and T. socranskii, and 59% by P. gingivalis. Indomethacin completely recovered the depression of OPG expression in osteoblasts by T. denticola and T. socranskii to the level of the untreated osteoblasts. Indomethacin recovered the reduction of OPG expression by P. gingivalis to 67%. CONCLUSION: These findings suggest that the osteoclastogenesis by P. gingivalis, T. denticola, and T. socranskii is mediated by a RANKL-dependent pathway and that PGE(2) is a main factor in the pathway by the enhancing of RANKL expression and the depression of osteoprotegerin, a RANKL inhibitor.     

Paxillin phosphorylation and integrin expression in osteoblasts infected by Porphyromonas gingivalis

OBJECTIVE: We investigated early biological events initiated by Porphyromonas gingivalis infection of human osteoblasts, focusing on tyrosine-phosphorylation and the expression of key components in focal adhesion and cell signalling. DESIGN: Human primary osteoblasts were challenged for 1h with Porphyromonas gingivalis. Tyrosine-phosphorylation of paxillin and focal adhesion kinase (FAK) was examined by Western blotting. Changes in alpha3- and beta1-integrin mRNA expression were quantified by RT-PCR. RESULTS: Tyrosine-phosphorylation of paxillin was proportional to the size of the Porphyromonas gingivalis inoculum. FAK, a potential kinase for paxillin, was not activated. The amount of alpha3- and beta1-integrins, determined by Western blotting, did not vary significantly, while the corresponding mRNA levels fell significantly when a large bacterial inoculum was used. CONCLUSIONS: These results indicate that Porphyromonas gingivalis infection of osteoblasts in vitro triggers tyrosine-phosphorylation of paxillin but not FAK and modify alpha3- and beta1-integrin mRNA expression. This infection thus appears to have different effects on components with essential roles in focal adhesion (paxillin) and cell signalling (FAK and integrins).