双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究

目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法:将双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞株。通过RT-PCR和Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5-FC向5-FU的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5-FC(0,25,50,100,200,400,800mg/L)和/或GCV(0,2,4,8,16,32,64mg/L),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果:双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞成功:在载体转染的Y79细胞中,RT-PCR扩增出长度为403bp的特异条带,Western blot检测见一59kD大小的条带,与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低:转染Y79细胞中,5-FC向5-FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5-FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低,两组比较当5-FC浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0.05)。转染组间比较,当5-FC达200mg/L,GCV达16mg/L后,5-FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5-FC或GCV组,有统计学差异(P<0.05)。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK转染Y79细胞后,在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5-FC和GCV达到一定浓度时,它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。     

双自杀基因CDTK载体系统对裸小鼠Y79细胞皮下移植瘤的杀伤作用

目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体系统pc-ChCDTK对视网膜母细胞瘤的体内杀伤作用。方法:用G418筛选载体阳性转染的Y79细胞;通过皮下注射载体转染和未转染的Y79细胞致瘤BALB/C小鼠,每组10只。Y79细胞皮下移植术7d后,向成瘤裸小鼠腹腔注射前体药物5-Fc+GCV(5-Fc 500mg/kg+GCV 30mg/kg),连续给药15d,每天测量1次皮下移植瘤长径和短径,计算体积。末次给药后3d处死裸小鼠,取皮下移植瘤组织做HE染色,并提取组织RNA,用RT-PCR检测CDTK的表达。结果:未转染组裸小鼠8只成瘤,转染组裸小鼠7只成瘤。两组比较,转染组皮下移植瘤的体积较未转染组小,有统计学差异(P<0.05);转染组瘤组织HE染色中可见散在坏死组织。转染组皮下移植瘤组织中检测到403bp片段,与CDTK预期mRNA大小一致。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK系统对裸小鼠的视网膜母细胞瘤皮下移植瘤的生长有抑制作用。     

逆转录病毒载体携带自杀基因对晶状体上皮细胞的抗增生作用

围绕后发性白内障防治的实验研究是当前眼科研究的热点之一。现代白内障术后，残留的晶状体上皮细胞向后囊表面增生和移行，在后发性白内障的发生过程中起着重要作用。基因疗法为疾病的治疗开辟了一条新途径，有着广阔的前景。本实验用逆转录病毒载体携带自杀基因(HSV-tk基因)导入晶状体上皮细胞，随后再给予丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)，观察其对晶状体上皮细胞的影响，以期为将来后发性白内障的基因治疗奠定基础。     

自杀基因治疗机制及在眼科应用的研究进展

自杀基因治疗又称为基因介导的酶前体药物疗法,其机制为将自杀基因转导入肿瘤细胞,其编码的特定酶将无毒或低毒的前药转化为细胞毒性的代谢产物,引起细胞死亡.除这种直接杀伤作用外,还通过旁观者效应杀伤邻近或远处未转基因的细胞,显著扩大其杀伤效应.自杀基因治疗在眼科应用于视网膜母细胞瘤、晶状体后囊膜混浊、增生性玻璃体视网膜病变及脉络膜黑色素瘤的治疗,目前大量实验尚属于临床前研究,是一种有前景的治疗方法.     

病毒载体介导的视网膜基因转移研究进展

用病毒作为载体携带功能基因转染视网膜以达治疗目的,这种基因治疗方法为某些遗传性视网膜病如视网膜色素变性的治疗开辟了新途径。应用腺病毒或腺相关病毒载体,经视网膜下间隙或玻璃体注射,可使报告基因在视网膜细胞中有效表达。腺病毒介导的基因表达起效早,持续时间短,腺相关病毒介导的基因表达起效晚,持续时间长。病毒载体中所含启动子的不同,其基因导致人的靶组织也不同。含茂细胞病毒启动子的病毒载体可将基因转移至视网膜色素上皮细胞,应用视紫红质启动子则转移至视细胞。     

视网膜母细胞瘤自杀基因疗法的研究进展

视网膜母细胞瘤（Rb)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,其发病率有逐渐升高的趋势。Rb的恶性程度高,发病早,可侵及单眼和双眼,对视功能的损害极大,甚至威胁生命,自杀基因疗法是目前肿瘤基因治疗中一种具有很大临床应用前景的治疗策略。但其用于视网膜母细胞瘤治疗的研究近年才刚刚起步,本综述从作用机制,旁观效应,设计策略及基础实验的疗效评估等方面介绍近年来视网膜母细胞瘤自杀基因疗法的研究进展。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应研究

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastcraa,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用阳离子脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入人视网膜母细胞瘤株HXO-Rb44细胞,荧光显微镜下观察转染效果,并用潮霉素筛选出转染阳性细胞HXO-Rb44／tk.RT-PCR鉴定hytk基因在HXO-Rh44细胞中的整合转录结果。比较转染前后Rb细胞的形态和生长特性。通过MTT法检测GCV对HXO-Rb44/tk细胞的杀伤作用以及对不同比例HXO-Rb44/tk和混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果转染效率约为20％。HXO-Rb44／tk细胞mRNA经RT-PCR可检测出530bp的hytk基因片段。转染前后Rb细胞的形态和生长特性无明显改变。HXO-Rb44／tk细胞对GCV高度敏感,并表现出时间和和剂量的依赖性。HSV-tk/GCV系统对Rb细胞的杀伤过程中存在明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rh44/tk细胞上清对HXO-Rb44细胞生长无影响。结论 HSV-tk基因转移联合GCV治疗可作为视网膜母细胞瘤基因治疗的一种有效方法,GCV代谢产物通过细胞间缝隙连接进行转运可能是此系统旁观者效应的主要机制。     

柔红霉素对转染hTERT基因的人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的 研究柔红霉素(DNR)对外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染的人晶状体上皮细胞(HLECs)生长的抑制作用及有效药物质量浓度。方法 采用脂质体转染技术,将编码hTERT基因的真核细胞表达质粒pCI-neo-hTERT的质粒ONA导入培养的HLECs,用G418筛选转染成功的抗性克隆并扩大培养,用细胞计数法分别比较转染前后的细胞生长曲线和群体倍增水平(PDL);用MTT比色法检测柔红霉素对转染后HLECs增殖的抑制作用。结果 获得一个可传代达32个群体倍增水平的HLECs克隆,转染后HLECs的生长率高于原代细胞,DNR质量浓度为0.4μg/ml作用1h和0.1μg/ml作用24h能明显抑制转染后的HLECs的增殖(P<0.01),1h和24h的50％抑制质量浓度(ID_(50))分别为2.4μg/ml和0.35μg/ml。结论 外源性hTERT基因的表达可以提高细胞的增殖能力,DNR能有效抑制转染后HLECs的生长。     

视紫红质基因启动子的分离及视网膜特异表达载体的构建

目的 分离视紫红质基因启动子，构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的视网膜特异表达载体，为今后视网膜细胞特异的靶向基因转移，特别是为视网膜疾病的基因治疗提供T具。方法 根据小鼠视紫红质基因5’端DNA顺序合成引物，通过PCR技术从小鼠基因组DNA中扩增524bp DNA片段，然后插入质粒pEGFP-1GFP编码基因上游的多克隆位点处，构建表达载体pmRho-EGFP。采用脂质体包裹pmRho-EGFP，转染体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞及其他来源的细胞；注射到SD大鼠视网膜下或玻璃体腔内；或通过电穿孔直接转移到RCS大鼠腓肠肌内。GFP表达采用荧光显微镜观察。结果 pmRho-EGFP在体外培养的人RPE细胞中的表达水平明显高于其他组织来源的细胞；体内转染实验证明pmRho-EGFP可在大鼠视网膜神经细胞中表达，但在大鼠腓肠肌中不表达。结论 小鼠视紫红质基因5’端524hp片段具有基本的启动子活性，能够调控基因在视网膜神经细胞及色素上皮细胞中表达，并具有一定的组织和细胞特异性。     

人RPE细胞端粒酶及hTERT基因的表达及意义

目的探讨人RPE细胞中端粒酶及hTERT基因的表达、关系及意义.方法应用原位分子杂交技术及端粒重复序列扩增方法(TRAP)检测人RPE细胞中hTERT和端粒酶活性的表达.结果原位杂交结果显示端粒酶hTERT基因在人RPE细胞中低水平表达;端粒酶活性定量检测结果显示,端粒酶活性在人RPE细胞中呈弱表达.结论人RPE细胞hTERT基因的表达水平与端粒酶活性表达一致,表明hTERT基因为端粒酶活性的限制性组份.     

携带 Tum5 基因的慢病毒表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

目的:构建及鉴定Tum5基因慢病毒表达载体,并观察在体外人血管内皮细胞中的表达。方法:采用PCR技术从含有tumstatin基因的质粒克隆模板pSPORT1-Sfi钓取Tum5基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum5,通过酶切、测序验证Tum5基因后,将pGC-FU-Tum5质粒和包装质粒pHelper1.0,pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tum5基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-Tum5,并转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞。通过检测标志蛋白-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的蛋白Tum5进一步验证pGC-FU-Tum5在靶细胞中Tum5的表达。结果:(1)pGC-FU-Tum5中携有正确的Tum5基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-Tum5共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-Tum5;(2)目的基因Tum5能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人脐静脉血管内皮细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到Tum5蛋白在靶细胞中的表达。结论:成功构建了携带Tum5基因的重组慢病毒载体,转染人脐静脉血管内皮细胞后能够稳定表达Tum5基因,为进一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治疗奠定基础。     

Construction and identification of the eukaryotic expression vector carrying specific siRNA of LEDGF p52 gene

To construct and identify LEDGFp52 eukaryotic expression vector for RNA interference. · METHODS: Recombinants were designed and established by targeting gene LEDGFp52 and plasmid pGensil-1 based on LEDGFp52 cDNA sequences of Genomes. Two pairs of oligonucleotides were synthesized according to the Tuschl principle and inserted into plasmid pGenSil-l to generate siRNA eukaryotic expression vector. DH5α strains were transformed, plasmids were extracted, and recombinant vectors were identified by the restriction map and the sequence analysis. The cultured cells were transfected by the recombinant plasmid (pGensil-1-RNA.LEDGFp52-1). At 48 hours after transfection, the whole cell protein was extracted, and the protein level was detected using Western blotting with mouse anti-human LEDGFp52 monoclonal antibody.　 · RESULTS: Recombinant plasmids completely concord with the designs by the restriction map and the sequence analysis, the protein level of LEDGFp52 was down-regulated at 48 hours after transfecting pGensil-1-LEDGFp52-1 expression vector into HeLa cells, the recombinant eukaryotic expression vectors were successfully constructed. · CONCLUSION: siRNA recombinant can be successfully constructed by RNAi technique to inhibit the expression of LEDGFp52.     

LEDGFp52-siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的: 构建 LEDGFp52 基因 RNA 干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法: 以 LEDGFp52 为靶基因, 以 pGenSil-l 质粒为载体, 设计构建重组体, 根据 GenBank 数据库提供的LEDGFp52 基因核苷酸序列, 按照 Tuschl 设计原则, 选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列, 克隆到空载体pGenSil-l 中, 转化 DH5α菌株, 提取质粒, 进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果: 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致, 重组载体构建成功,重组质粒转染 HeLa 细胞48h, Western blotting 检测到 LEDGFp52 蛋白表达的改变。结论: 利用 RNAi 技术可成功构建抑制 LEDGFp52 表达的小干扰 RNA 重组体。     

特异性启动子LEP503介导的自杀基因系统对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的构建晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)特异性启动子LEP503(lens epithelium gene product503)调控的Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP载体,观察慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙环鸟苷系统(herps simplex virus thymidine kinase/ganciclov-ir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统对人晶状体上皮细胞(HLEC)增殖的靶向性抑制作用。方法用RT-PCR方法从HLEC基因组中克隆LEP503启动子序列,构建单纯LEP503启动子调控HSV-tk基因表达的慢病毒载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP,同时构建广谱启动子巨细胞病毒(cytomegalo virus,CMV)调控的HSV-tk载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。将特异性表达载体Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC和Hela细胞,用荧光显微镜观察荧光强度,用RT-PCR方法评估相关蛋白的组织特异性表达。将Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP和Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP分别转入HLEC,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,用流式细胞仪及RT-PCR比较CMV与LEP503启动子介导下游靶基因HSV-tk的表达差异。结果 Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP能在HLEC中特异性表达,但Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的表达效率明显低于Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP。转染Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP的HLEC在20mg·L-1GCV作用48h后EGFP阳性细胞的形态发生明显变化;GCV作用24h后Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染HLEC较正常HLEC和Lenti-LEP503-HSV-tk-EGFP转染Hela细胞活性有明显抑制,且随时间的延长抑制效果逐渐增强。结论 LEP503启动子能介导HSV-tk基因在HLEC中特异表达,并介导HSV-tk/GCV自杀基因系统靶向性抑制HLEC增殖,但该启动子表达效率较低,所介导的HSV-tk/GCV系统对HLECs增殖的抑制效率低于CMV启动子。     

A 350 bp region of the proximal promoter of Rds drives cell-type specific gene expression

RDS (retinal degeneration slow) is a photoreceptor-specific tetraspanin protein required for the biogenesis and maintenance of rod and cone outer segments. Mutations in the Rds gene are associated with multiple forms of rod- and cone-dominant retinal degeneration. To gain more insight into the mechanisms underlying the regulation of this gene, the identification of regulatory sequences within the promoter of Rds was undertaken. A 3.5 kb fragment of the 5′ flanking region of the mouse Rds gene was isolated and binding sites for Crx, Otx2, Nr2e3, RXR family members, Mef2C, Esrrb, NF1, AP1, and SP1 in addition to several E-boxes, GC-boxes and GAGA-boxes were identified. Crx binding sequences were conserved in all mammalian species examined. Truncation expression analysis of the Rds promoter region in Y-79 retinoblastoma cells showed maximal activity in the 350 bp proximal promoter region. We also show that inclusion of more distal fragments reduced promoter activity to the basal level, and that the promoter activities are cell-type and direction specific. Co-transfection with Nrl increased promoter activity, suggesting that this gene positively regulates Rds expression. Based on these findings, a relatively small fragment of the Rds promoter may be useful in future gene transfer studies to drive gene expression in photoreceptors.     

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及其体外表达

目的构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子p52(lens epithelium derivedgrowthfactor p52,LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测LEDGFp52重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因的重组腺病毒载体pAd-LEDGFp52,将pAd-LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,将Ad-LEDGFp52体外转染293细胞,CPE法及Westernblot观察目的基因的表达。结果构建了表达LEDGFp52基因的重组腺病毒质粒,E.coli内成功同源重组腺病毒,在293细胞内包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,滴度可达5×1012PFU·L-1。在真核细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,出现显著的CPE效应。结论成功构建表达LEDGFp52的重组腺病毒载体,为进一步进行LEDGF p52基因功能的研究提供了实验基础。     

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及体外表达

目的: 构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子 p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测 LEDGFp52 重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法: 将 LEDGFp52 基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack- CMV上构建腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV- LEDGFp52 与5 型腺病毒骨架质粒 pAdeasy- 1 共转染 BJ5183 细菌, 经细菌内同源重组产生携带 LEDGFp52 基因的重组腺病毒载体 pAd- LEDGFp52, 将 pAd- LEDGFp52 经脂质体法转化293 细胞包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 将 Ad-LEDGFp52 体外转染 293 细胞, CPE 法及 westernblot 观察目的基因的表达。结果: 构建了表达 LEDGFp52 基因的重组腺病毒质粒, E.coli 内成功同源重组腺病毒, 在 293 细胞内包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 滴度可达 5×1012 pfu/L。在真核细胞中有效表达目的基因 LEDGFp52, 出现显著的 CPE 效应。结论: 成功构建表达 LEDGFp52 的重组腺病毒载体, 为进一步进行 LEDGF p52 基因功能的研究提供了实验基础。