茶多酚二甲亚砜合剂对铀矿尘人支气管细胞毒性的防护作用

目的探讨铀矿尘所致人支气管细胞BEAS-2B细胞DNA损伤以及茶多酚二甲亚砜合剂对细胞的防护作用。方法 BEAS-2B细胞中加入铀矿尘、铀矿尘+茶多酚、铀矿尘+二甲亚砜、铀矿尘+茶多酚二甲亚砜合剂染毒24 h后,通过检测微核和多核细胞观察染色体损伤,彗星实验及H2AX蛋白磷酸化检测DNA的损伤,多核细胞法检测细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)突变。结果与正常对照组相比,BEAS-2B细胞经铀矿尘染毒后,细胞的微核率、多核率和拖尾率明显升高,H2AX蛋白磷酸化表达增高,HPRT突变率明显增高(P<0.05),铀矿尘+茶多酚、铀矿尘+二甲亚砜和铀矿尘+茶多酚二甲亚砜合剂保护能有效降低上述变化(P<0.05),其中茶多酚二甲亚砜合剂的保护效果最好。结论铀矿尘对BEAS-2B细胞DNA具有损伤作用,茶多酚二甲亚砜合剂有较强防护作用。     

2-乙酰氨基芴诱导γH2AX焦点的形成

目的探讨DNA损伤剂2-乙酰氨基芴(2-AAF)是否可诱导γH2AX焦点的形成及γH2AX作为检测DNA损伤的一个新的特异指标的可能性。方法用2-AAF处理中国仓鼠CHL细胞,应用免疫荧光方法检测γH2AX焦点的形成,并通过中性彗星实验验证DNA损伤的程度。结果0.1,1,5和20mg·L-1的2-AAF都可使细胞核内γH2AX焦点数量及有γH2AX焦点生成的细胞数量增加,但只有20mg·L-12-AAF处理的细胞才出现明显的彗尾增长及有彗尾的细胞数量增加。另外,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族抑制物渥曼青霉素可抑制2-AAF诱导的γH2AX焦点形成。结论2-AAF可通过激活PI3K家族成员使H2AX磷酸化,进而诱导γH2AX焦点的形成。γH2AX检测DNA损伤的敏感性优于彗星实验,因此,γH2AX有可能成为衡量DNA损伤程度的良好指标。     

γH2AX:DNA双链断裂的标志

γH2AX是目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一。细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂(DSBs) ,以及细胞自身调控的程序性DSBs和逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs均可诱导H2AX的磷酸化(γH2AX)和簇集。本文对H2AX及其组蛋白家族,以及γH2AX与DSBs之间的关系及可能作为一个探测DNA损伤的新分子探针来利用作一简要综述。     

γH2AX的检测方法简介

DNA损伤有许多不同的形式，如碱基修饰，DNA单链断裂（DNA single stranded breaks，SSBs），DNA链内和链间交联以及DNA双链断裂（DNA double stranded breaks，DSBs）等，其中DSBs被认为是DNA最严重的损伤。细胞在DSBs发生后，产生一系列的应激反应，其中一个主要的反应就是毛细血管共济失调突变基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）起始的信号级联反应，它使细胞周期停顿直到损伤修复。H2AX是这一信号级联反应中的一个主要成员，它能被ATM磷酸化（称为γH2AX，或ganunaH2AX），并在随后的损伤修复过程中发挥着重要的作用。     

DNA损伤标志物γ-H2AX及其在毒性测试应用中的研究进展

当DNA受到攻击尤其是发生DNA双链断裂(DSB)后,组蛋白H2AX的139位丝氨酸迅速磷酸化,生成磷酸化H2AX即γ-H2AX.γ-H2AX在DSB位点大量聚集并形成焦点,参与DNA的损伤修复,且γ-H2AX焦点数与DSB数量成正比.目前研究表明,γ-H2AX是表征DNA损伤的特异性生物标志物,可作为基因毒性的特异性...     

新型化合物XN4抑制急性粒细胞白血病细胞增殖与其诱导氧化性的DNA损伤的关系

目的研究XN4在体外抑制急性粒细胞白血病细胞(AML)增殖的作用与诱导DNA损伤的关系。方法 MTT法检测XN4对AML细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测AML细胞反应性氧自由基(ROS)、DNA损伤、细胞周期和细胞凋亡;Western blot探讨XN4对相关蛋白表达的影响。结果 XN4明显抑制AML细胞增殖,半数抑制率(IC50)分别为(2.79±0.15)μmol·L-1和(2.76±0.20)μmol·L-1;XN4增加细胞ROS水平和r-H2AX的表达,诱导细胞阻滞在S期并增加细胞凋亡率;XN4能增加H2AX、ATM的磷酸化以及Parp和Caspase-3的切割,而减少CDK2和Cyclin E1的表达。结论 XN4通过激活ROS,诱导DNA的损伤和细胞周期S期阻滞,抑制DNA损伤修复和诱导细胞的凋亡,抑制HL-60及KG1α细胞的增殖,抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)能减少ROS的产生逆转XN4的作用。     

EGCG通过p38信号因子诱导IFN-β抗甲型流感病毒感染的研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）通过p38信号因子诱导IFN-β抑制甲型流感病毒H1N1复制作用机制。方法 将EGCG作用于人气管上皮细胞（BEAS-2B），通过qRT-PCR和ELISA检测BEAS-2B中IFN-β mRNA和蛋白的表达，Western blotting检测p38和p-p38蛋白表达；使用p38抑制剂抑制p38信号因子的信号传导，检测EGCG作用BEAS-2B细胞诱导的IFN-β蛋白和mRNA表达；用IFN-β抗体中和细胞中IFN-β的产生，通过qRT-PCR和Western blotting检测EGCG作用H1N1后NP蛋白和mRNA的表达。结果 与EGCG（0 μg·mL^-1）相比，随着EGCG剂量增加，IFN-β蛋白和mRNA明显增加。与作用0 h相比，EGCG（20 μg·mL^-1）作用细胞12 h时诱导IFN-β蛋白表达显著（P<0.01）。EGCG可促进BEAS-2B中p38磷酸化；使用p38抑制剂抑制p38信号通路后，EGCG诱导IFN-β mRNA和蛋白表达减少（P<0.01）。与EGCG单独治疗感染H1N1的细胞相比，EGCG和IFN-β抗体共同治疗，可明显升高感染细胞中NP蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。结论 EGCG可通过上调p38信号因子磷酸化水平诱导BEAS-2B产生IFN-β，从而抑制H1N1复制。     

ST2负向调控铜绿假单胞菌外膜囊泡诱导肺上皮细胞分泌细胞因子

目的 研究受体分子ST2在铜绿假单胞菌外膜囊泡（OMVs）诱导肺上皮细胞分泌促炎细胞因子中的负向调控作用。方法 将气道上皮细胞BEAS-2B分为对照组和低、中、高浓度实验组。对照组给予等体积磷酸盐缓冲液刺激;低、中、高实验组分别用1,10和30μg·mL^-1的OMVs刺激。用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法分别检测ST2 mRNA和蛋白的表达水平,用Western blot法检测细胞核内p65、H3和H4乙酰化,用酶联免疫吸附实验法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌,用染色质共沉淀检测组蛋白和ST2启动子的结合,用荧光素报告基因测定核转录因子κB（NF-κB）的酶活性。结果 BEAS-2B细胞经OMVs处理后,低、中、高浓度实验组均可导致ST2转录水平和翻译水平明显增高,并能上调细胞核内p65的表达水平以及细胞核内H3和H4乙酰化;同时,低、中、高浓度实验组的TNF-α和IL-8分泌水平也显著增高。染色质共沉淀结果显示,H3和H4组蛋白能和ST2启动子区域结合。报告基因结果也显示,ST2能和NF-κB启动子结合...     

乌司他丁对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞MAPK/Sirt3/Foxo3a通路相关自噬的影响

摘要：目的:探讨乌司他丁（UTI）对缺氧/复氧（H/R）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）自噬的影响,并初步研究其作用机制。方法:体外培养HK-2细胞,并建立H/R损伤模型,随机分为对照组、H/R组、UTI低、中、高剂量组;噻唑蓝（MTT）法检测各组HK-2细胞存活率变化情况;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）法检测各组HK-2细胞凋亡情况;酶联免疫吸附法检测各组HK-2细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）表达水平;蛋白印迹分析法检测微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ（LC3Ⅰ/Ⅱ）、核孔蛋白62（p62）、沉默信息调节因子3（Sirt3）和叉头框蛋白O3a（Foxo3a）蛋白表达及丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化水平。结果:与对照组相比,H/R组HK-2细胞存活率、p62蛋白和p38 MAPK磷酸化水平显著降低（P<0.05）,细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平、LC3II/LC3I、Sirt3和Foxo3a蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与H/R组相比,UTI低、中、高剂量组HK-2细胞存活率、LC3II/LC3I、Sirt3和Foxo3a蛋白表达水平依次升高（P<0.05）,细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平、p62蛋白和p38 MAPK磷酸化水平依次降低（P<0.05）,呈剂量依赖性。结论:UTI能够增强H/R诱导下HK-2细胞自噬,降低炎症反应,可能与抑制p38 MAPK磷酸化,激活Sirt3/Foxo3a通路相关。     

同源重组和非同源末端连接修复参与黄芩素诱导的DNA损伤耐受机制研究

目的 研究黄芩素诱导的DNA损伤修复机制.方法 采用CCK8试验检测黄芩素对鸡淋巴瘤B细胞(DT40细胞)增殖的影响;采用免疫荧光试验分析黄芩素诱导野生型(WT)和DNA修复缺陷型DT40细胞γ-H2AX foci的变化;采用流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 黄芩素对DT40细胞呈剂量依赖性抑制,且与WT细胞比较,同源重...     

三丁基锡对蛋白磷酸酶2A的抑制机制

目的：研究三丁基锡（TBT）对人羊膜FL细胞蛋白磷酸酶2A（PP2A）活力的抑制机制。方法 FL细胞经不同浓度TBT染毒1 h后,检测PP2A活力及PP2A组成亚基A、C、B55α和B56δ以及C亚基蛋白磷酸化和甲基化水平。结果与对照组比较,3、4、6μmol/L染毒FL细胞内PP2A活力均下降,差异有统计学意义（P＜0.01）;6μmol/L TBT染毒组FL细胞内PP2A组成亚基A蛋白的表达下降,4、6μmol/L TBT染毒组B55α蛋白的表达及C蛋白甲基化水平均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 TBT对FL细胞PP2A活力的抑制作用可能与其抑制B55α和A蛋白亚基表达,降低C亚基Leu309位点的甲基化水平有关。     

DNA双链断裂诱导的细胞损伤应答反应研究进展

DNA双链断裂(DSB)能通过级联激活细胞信号传导通路,启动DNA修复系统以保证遗传信息的完整。细胞对DSB的DNA损伤应答(DDR)系统是由感应器、传递器及下游效应器分子组成的。首先,感应器在感受到DSB的存在后,激活磷脂酰肌醇激酶相关激酶(PIKKs)家族成员,后者可使组蛋白H2AX磷酸化(γH2AX)。γH2AX被认为是DSB的标志,可聚集大量效应分子在DSB位点进行修复,在此过程中则引起细胞周期停滞,染色体结构改变,甚至细胞自噬或凋亡。本文将简单概述当前对DSB细胞应答系统的研究进展。     

依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型的构建及鉴定

目的 用依托泊苷(etoposide)诱导类器官发生DNA损伤构建人小肠类器官衰老模型。方法 临床活检小肠组织，体外无菌分离获得小肠隐窝，在培养基中培养成为类器官。类器官用依托泊苷10μmol·L^-1处理7 d，倒置相差显微镜观察类器官表面形态变化，Western印迹法检测DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)水平；衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色检测类器官SA-β-gal阳性细胞面积百分率，Western印迹法检测衰老标志物p16^INK4A蛋白表达水平。结果 人小肠隐窝体外成功培养成球。依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型表面皱缩，类器官部分死亡，整体表面积变小；类器官中γH2AX蛋白表达显著上调(P<0.01);SA-β-gal阳性细胞面积百分率显著增加(P<0.01)，约90%细胞呈SA-β-gal阳性；p16^INK4A蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论 依托泊苷处理可诱导人小肠类器官发生DNA损伤，从而诱导人小肠类器官衰老。     

RITA通过ROS/Src/Stat3通路诱导肺鳞癌H226细胞凋亡

目的 探究肿瘤凋亡和P53再生化合物（RITA）对肺鳞癌细胞凋亡的影响及作用机制。方法 采用MTT 细胞活力检测法检测不同浓度RITA对肺鳞癌细胞H226和正常肺上皮细胞BEAS-2B增殖的影响,筛选合适的干预 浓度。经0、0.05、0.1和0.2 μmol/L RITA处理后,采用流式细胞术分析H226细胞内活性氧（ROS）产生和细胞凋亡水 平变化。Western blot 检测 P-Src、Src、转录信号转换器和激活因子 3（Stat3）、P-Stat3、Bim、Mcl-1、存活蛋白 （Survivin）、Bax及B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的蛋白表达水平。H226细胞经0.2 μmol/L RITA 和5.0 mmol/L 抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC）同时处理后,观察NAC能否逆转RITA对H226细胞的生物学效应。结果 0.05~0.2 μmol/L 范围内,随着RITA浓度的升高,H226细胞增殖活性下降,半抑制浓度（IC50）为（0.130±0.008）μmol/L,而相同给药浓 度下对 BEAS-2B 细胞增殖无明显影响。0~0.2 μmol/L RITA 可增加 H226 细胞内 ROS 水平并诱导细胞凋亡,下调 P-Src、P-Stat3、Mcl-1、Survivin、Bcl-2蛋白表达,上调Bim、Bax蛋白表达。经NAC处理后,RITA抑制Src/Stat3通路活 性及诱导H226细胞凋亡的效应被逆转。结论 RITA通过提高肺鳞癌H226细胞内ROS的水平,从而抑制Src/Stat3 通路活性,最终诱导细胞凋亡。     

南蛇藤多萜通过抑制Chk1介导胃癌细胞DNA损伤并诱导其凋亡

目的从DNA损伤应答角度探讨南蛇藤多萜(the total terpenoids of Celastrus orbiculatus Thunb.,TTC)对胃癌细胞的抑制作用。方法CCK-8实验考察不同浓度(0、20、40、80、160、320 mg·L^-1)的南蛇藤多萜对胃癌细胞的毒性影响;克隆形成率实验检测TTC对胃癌细胞的克隆形成的影响;彗星实验分析南蛇藤多萜对胃癌细胞DNA的影响;Western blot实验检测DNA损伤相关蛋白γH2AX、Poly-PAR、p-Chk1以及cleaved-PARP1的影响。结果TTC在24 h,48 h,72 h对AGS和MKN-45细胞的IC 50分别是421.1、99.68、58.57 mg·L^-1和308.2、124.1、68.21 mg·L^-1;克隆形成实验表明5、10 mg·L^-1的TTC对AGS和MKN-45细胞的克隆形成抑制率分别为29.67%、61.46%和42.73%、64.39%;TTC能够加重胃癌细胞DNA损伤而同等剂量对正常胃粘膜上皮细胞GES-1细胞DNA几乎无损伤;TTC能够增加DNA单双链断裂Poly-PAR、γH2AX蛋白的表达;抑制Chk1的磷酸化水平表达,并增加cleaved-PARP1的蛋白表达。结论TTC能够抑制DNA损伤应答激酶Chk1的激活,从而诱导胃癌细胞DNA单双链断裂加剧最终诱导细胞凋亡。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨阿司匹林对缺氧/复氧H9c2细胞凋亡的影响

摘要：目的:探究阿司匹林（aspirin）对缺氧/复氧（H/R） H9c2心肌细胞凋亡的影响及其与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/m TOR）信号通路的关系。方法:正常培养H9c2心肌细胞16 h,作为对照组（control组）;缺氧、复氧处理H9c2心肌细胞,作为H/R组;培养基中加入aspirin,作为H/R+aspirin组;培养基中加入阻断剂LY294002,作为H/R+aspirin+PI3K/AKT特异阻断剂LY294002组（H/R+aspirin+LY组）;检测细胞活力、细胞凋亡情况及细胞中PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化m TOR（p-mTOR）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表达情况。结果:H/R组H9c2心肌细胞存活率低于Control组,凋亡率高于Control组（P<0.05）; aspirin预处理组细胞存活率高于H/R组,H/R+aspirin组H9c2心肌细胞凋亡率低于H/R组（P<0.05）; H/R+aspirin+LY组细胞存活率低于H/R+aspirin组,细胞凋亡率高于H/R+aspirin组（P<0.05）。H/R组H9c2心肌细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、caspase-3蛋白表达高于Control组,Bcl-2蛋白表达低于Control组（P<0.05）; H/R+aspirin组H9c2心肌细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白表达高于H/R组,caspase-3蛋白表达低于H/R组（P<0.05）; H/R+aspirin+LY组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2蛋白表达低于H/R+aspirin组,caspase-3蛋白表达高于H/R+aspirin组（P<0.05）。结论:aspirin预处理可减轻H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤,显著提高心肌细胞存活率,减少细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路实现的。     

黄腐醇对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护机制研究

摘要：目的:研究黄腐醇体外缓解过氧化氢（H2O2）诱导SH-SY5Y细胞死亡的抗氧化损伤机制。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,采用MTT法分别研究不同浓度的黄腐醇对SH-SY5Y细胞的毒性作用和对H2O2诱导细胞损伤的保护作用;采用流式细胞仪和显微成像实验检测黄腐醇对细胞内活性氧（ROS）水平的影响;采用免疫荧光实验检测黄腐醇对核因子E2相关因子2（Nrf2）核转位的影响及用Western Blot分析黄腐醇对抗氧化蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的影响。结果:黄腐醇浓度≤0.5μmol·L-1时对SH-SY5Y细胞无毒性作用,黄腐醇对H2O2诱导的细胞损伤具有浓度依赖性保护作用（P<0.05或P<0.01）;同时黄腐醇能降低H2O2诱导的细胞内ROS水平和促进Nrf2核转位（P<0.05）及浓度依赖性地提高HO-1和GCLC蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。结论:黄腐醇具有一定的细胞保护作用,其通过激活Nrf2通路缓解H2O2诱导SH-SY5Y细胞的氧化损伤。     

干扰survivin表达减少肿瘤细胞对紫外线诱导DNA损伤的修复作用

目的：研究生存素（survivin）对紫外线（UV）诱导的肿瘤细胞DNA损伤修复作用及其机制。方法：本研究构建和包装survivin蛋白shRNA慢病毒载体;依据逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法确定干扰效果;采用宿主细胞复活法（HCR）检测survivin蛋白表达对细胞整体DNA损伤修复能力的影响。结果：干扰survivin的表达显著降低肺腺癌H1299细胞对UV诱导DNA损伤的修复能力。结论：Survivin在UV诱导DNA损伤的修复作用中扮演重要角色。本研究可以为以survivin为靶点的肿瘤治疗提供一定的理论依据。     

nNOS抑制剂亚胺基烯丁基-L-鸟氨酸对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

目的 探讨nNOS选择性抑制剂亚胺基烯丁基-L-鸟氨酸（L-VNIO）对心肌缺血再灌注（I/R）损伤的影响及机制。方法 构建SD大鼠离体心脏I/R模型和H9c2细胞缺氧/复氧（H/R）模型；nNOS抑制剂L-VNIO（10 μmol·L^-1）持续给药整个再灌注或复氧过程。TTC染色测定心肌梗死面积；流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率；Fluo-3/AM Ca²⁺荧光探针通过流式细胞仪检测H9c2细胞内Ca²⁺浓度；试剂盒法测定离体心脏灌流液乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）水平以及H9c2细胞MDA水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性；离体心脏提取肌浆网，试剂盒法检测肌浆网Ca²⁺-ATP酶（SERCA）活性，Western blotting检测肌浆网SERCA蛋白表达；Western blotting检测离体心脏中受磷蛋白（PLB）和兰尼碱受体2（RyR2）蛋白表达水平和磷酸化水平。结果 与I/R或H/R模型组相比，L-VNIO显著降低细胞凋亡率，减少心肌梗死面积，降低LDH、MDA水平，提高SOD活性，差异均有统计学意义（P<0.05）；此外，与I/R或H/R模型组相比，L-VNIO组明显降低细胞内Ca²⁺超载，增高PLB磷酸化水平，降低RyR2磷酸化水平，增强SERCA活性（P<0.05）。结论 nNOS抑制剂L-VNIO可以减轻I/R损伤，机制与调节Ca²⁺转运相关蛋白而降低I/R引起的Ca²⁺超载相关。     

环磷酰胺衍生物SLXM-2对小鼠肝癌H_（22）细胞的DNA损伤作用

化合物SLXM-2是一种环磷酰胺衍生物,前期研究已经证实其具有良好的肿瘤抑制作用,并具有较低的毒副作用。但是其作用机制尤其是对细胞DNA的损伤作用仍不清楚。本研究旨在评价SLXM-2对肝癌H22腹水小鼠的生命延长作用与DNA损伤的关系,并探讨可能的分子机制。实验结果证实,SLXM-2能够显著提高肝癌H22腹水小鼠的生命延长率（P〈0.05）。进一步实验表明,SLXM-2能够造成肝癌H22细胞DNA损伤,显著上调γH2AX（Ser139）,p-Chk1（Ser296）,p-Chk2（Thr68）,p-p53（Ser15）,p-p53（Ser20）和p21的蛋白表达,并显著下调p-ATR（Ser428）和p-ATM（Ser1981）的表达（P〈0.05）。总之,SLXM-2对肝癌H22细胞具有显著的抑制作用,分子机制与其能够造成肿瘤细胞DNA损伤有关。