重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

IL-10基因在大鼠骨髓树突状细胞的表达

目的检测人白细胞介素10（hIL-10）基因在大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（immature dendritic cell,imDC）中的表达。方法实验分4组：mDC组、imDC组、空载体组及hIL-10基因转染组。用hIL-10真核表达载体（pIRES2-EGFP-hIL-10）转染大鼠骨髓来源的imDC,应用ELISA、Western blot、流式细胞术及混合淋巴细胞反应（MLR）检测hIL-10在各组中的表达。结果荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP—hIL-10质粒转染imDC后可见绿色荧光;ELISA检测hIL-10基因转染组的hIL-10表达明显高于mDC组、imDC组及空载体组;经Westen blot检测hIL-10基因转染组有hIL-10蛋白表达;流式细胞术显示hIL-10基因转染组hIL-10基因转染后imDC表面分子CD86、CD80与其他三组相比略呈低表达;转染后混合淋巴细胞反应（MLR）显示,hIL-10转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组和空载体组（P=0．024和P=0．033）。结论外源性hIL-10基因成功导入大鼠imDC并表达。     

B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用

目的：研究B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞的抑制作用。方法：制备B16F10黑素瘤细胞培养上清,作用于同基因小鼠脾淋巴细胞,通过PHA刺激和混合淋巴细胞反应,用MTT法检测淋巴细胞的增殖活性。结果：在B16F10黑素瘤细胞培养上清的作用下,PHA诱导的同基因小鼠脾淋巴细胞增殖率平均为63.00%,明显低于对照组,差异有显著性（t=16.447,p=0.000）;混合淋巴细胞反应的淋巴细胞增殖率平均为61.82%,亦明显低于对照组,差异有显著性（t=8.097,P=0.000）。结论：B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞的增殖具有抑制作用。     

表达人IL-21的细胞因子诱导的杀伤细胞对裸鼠肝癌的治疗研究

目的 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK细胞)作为人IL-21(hIL-21)基因的载体治疗肝癌的可行性.方法 构建携带hIL-21、CopGFP基因的质粒pDC759-hIL-21、pDC759-CopGFP并分别与pAd5、pAd5F35共转染HEK293细胞,包装表达hIL-21、CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒.分离培养CIK细胞并绘制生长曲线,将携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100、1 000)感染CIK细胞;将携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、20、50)感染SMMC-7721细胞48 h后检测hIL-21蛋白的表达;将携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100)感染CIK细胞48 h后检测hIL-21蛋白的表达.皮下注射SMMC-7721细胞致裸鼠成瘤,以表达hIL-21的CIK细胞治疗荷瘤裸鼠,评价疗效.结果 成功构建出用于Ad5、Ad5F35病毒的质粒;构建的质粒与pAd5、pAd5F35脂质体共转染HEK293细胞,包装出表达hIL-21及CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒.携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒对CIK细胞的感染实验表明Ad5F35腺病毒感染率更高;携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒对SMMC-7721细胞的感染实验表明hIL-21表达量差异无统计学意义;携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以50 MOI感染CIK细胞后hIL-21的表达量较高;动物实验统计分析说明表达hIL-21的CIK细胞对荷瘤裸鼠疗效较好.结论 hIL-21与CIK细胞在荷瘤小鼠体内联合发挥抗肿瘤作用.     

CD4+CD25+Treg细胞调节T细胞的作用机制分析

目的通过检测Treg细胞表达介导抑制性共刺激分子CTLA4和分泌抑制性细胞因子,并设置Treg细胞与效应性T细胞共培养和分隔培养实验模型,分析Treg细胞对效应性T细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系.方法对比分析Treg细胞与效应性T细胞膜分子CTLA4、CD28表达和细胞因子IL-10、TGF-β1分泌水平;以TransWell Millicell-PCF分隔培养槽分隔培养Treg细胞与不同淋巴细胞组成的反应体系,采用向共培养及分隔培养体系加入与不加入IL-10、TGF-β1抗体的阻断方法,检测Treg细胞对不同组混合淋巴细胞反应的抑制效率.结果 Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的浓度水平明显高于效应性T细胞,Treg细胞培养上清中IL-10和TGF-β1水平分别达到(380±36.3) pg/ml和(790±56.8) pg/ml,Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的浓度水平与效应性T细胞比较,均有显著性差异(P<0.01).共刺激分子CTLA4、CD28在Treg细胞和效应性T细胞膜表面的表达水平存在明显差异,Treg细胞以表达CTLA4为主.Treg细胞对共培养体系混合淋巴细胞反应的抑制效率明显高于分隔培养,通过分泌IL-10对效应性T细胞的抑制作用亦明显强于通过TGF-β1.结论细胞接触机制是Treg细胞抑制效应性T细胞的主要作用机制,而细胞因子机制中,以通过分泌IL-10的方式对效应性T细胞的抑制作用更明显.     

重构型Caspase-3基因对CNE2细胞的作用

目的 探讨Caspase-3基因表达对人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡诱导作用.方法 应用重组技术将重构型Caspase-3基凶亚克隆至带有报告基因的真核表达载体pEGFP中,脂质体介导转染人鼻咽癌细胞CNE2通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达:荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化;MTT法检测转染Caspase-3基因对CNE2细胞生长的影响.结果 RT-PCR方法证实重构型Caspase-3基因可在CNE2细胞内表达,形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征,结果表明Caspase-3对CNE2的细胞生长有抑制作用.结论 重构型Caspase-3对CNE2细胞的生长有抑制作用.     

Foxp3基因转染小鼠CD4+CD25-T细胞对同种T细胞增殖反应的影响

目的观察Foxp3基因转染的小鼠CD4 CD25-T细胞对同种T细胞增殖反应的影响。方法以免疫磁珠法分离小鼠脾细胞中的CD4 CD25 和CD4 CD25-T细胞,用流式细胞术检测细胞纯度,以电穿孔法将质粒PMFOXP3-IRES2-EGFP转染小鼠CD4 CD25-T细胞,用荧光显微镜观察转染细胞中Foxp3的表达,转染细胞和CD4 CD25 T细胞与同种T细胞做混合淋巴细胞培养,以3H-TdR掺入测定CPM值。结果在质粒PMFOXP3-IRES2-EGFP转染CD4 CD25-T细胞24h后,转染细胞中可检测到高水平的Foxp3;转染细胞和CD4 CD25 T细胞CPM值分别为3 927.0±674.7和3 895.3±504.6(P>0.05)。结论以质粒PMFOXP3-IRES2-EGFP转染的CD4 CD25-T细胞对同种T细胞增殖反应具有显著抑制作用,与CD4 CD25 T细胞的抑制作用等同。     

孕激素对小鼠脾细胞淋球菌感染模型NLRP3炎性体表达及Th17/Treg分化的影响

目的：研究孕激素对小鼠脾细胞淋球菌（Neisseria gonorrhoeae,Ng）感染模型中NLRP3炎性体表达及Th17/Treg分化的影响。方法：体外分离、培养小鼠脾细胞后,分为如下5组：空白对照组、Ng组、Ng+1×10-9 mol/L孕酮组、Ng+1×10-8 mol/L孕酮组、Ng+1×10-7 mol/L孕酮组。培养3 d后收集细胞,采用流式细胞术检测Th17/Treg细胞比例,利用实时荧光定量PCR检测各组细胞NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞NLRP3、Caspase?1p20、RORγt、Foxp3蛋白表达。ELISA法检测脾细胞培养上清中白细胞介素（interleukin,IL）?1β及Th17/Treg相关细胞因子IL?17、转化生长因子（transforming growth facfor,TGF）?β、IL?10水平。结果：脾细胞在淋球菌的刺激下,Th17细胞和Treg细胞比例增多,细胞内NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA和蛋白表达水平升高,Caspase?1p20蛋白表达水平升高,细胞培养上清中IL?1β、IL?17、TGF?β、IL?10含量增高（P < 0.01）;加入孕酮预处理后,随着孕酮作用浓度的增高,Th17细胞比例、细胞内NLRP3和RORγt的mRNA和蛋白表达水平、Caspase?1p20蛋白表达水平、细胞培养上清中IL?1β和IL?17含量均明显降低,Treg细胞比例、细胞内Foxp3 mRNA和蛋白表达、细胞培养上清中TGF?β和IL?10含量均明显增高,与Ng组比较差异有统计学意义（P < 0.01）。结论：孕激素可抑制Ng感染诱导的小鼠脾细胞NLRP3表达及Th17细胞分化,促进Ng感染诱导的Treg细胞分化。     

人类IL-3受体α亚单位与小鼠AIC2B蛋白的相互作用

目的探索人类IL-3受体(IL-3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法通过PCR扩增技术，构建了IL-3Rα亚单位胞浆域缺失突变子34、22和CD，然后将野生型和突变型IL-3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL-3R基因表达的BaF3细胞．并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果表达野生型hIL-3Rα／βc的BαF3阳性对照克隆在生理浓度hIL-3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白βc、Jak2及Shc磷酸化；而含野生型IL-3αRa亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL-3刺激的细胞增殖反应．但无信号传导分子的活化；共表达突变型IL-3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL-3刺激均无反应。结论尽管hIL-3Rβc亚单位在hIL-3诱导的信号传导过程中担负关键作用，但小鼠内源性AIC2B也可与hIL-3Rα重建功能性hIL-3R，这种功能的表达需要hIL-3Rα完整受体分子的存在。     

重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对大鼠肾移植存活时间的影响

目的 以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用.方法 采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察.结果 hIL-2-Luffin P1组大鼠存活时间延长(13.86±2.11)d,与对照组比较相差显著(P＜0.01);而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异.同时,病理结果显示对照组移植肾单位结构破坏,淋巴细胞浸润明显,而在同一时间hIL-2-Luffin P1处理组大鼠的移植肾脏病理变化较轻;T淋巴细胞亚群检测显示经hIL-2-Luffin P1处理后,受体外周血T细胞的活化程度降低.结论 hIL-2-Luffin P1能够抑制免疫排斥反应,延长移植物存活时间.     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

Regularity of ultraviolet (UV)-induced NIH3T3 cell damage and characteristics of DNA cleavage in UV-induced NIH3T3 cells apoptosis

INTRODUCTIONThesolarspectrumonthesurfaceoftheearthcomprisesultraviolet(UV),visibleandinfraredradiation,withrelativeintensityof3%,37%and60%respectively.Inaddition,X--raysandradiowaveshavebeendetected,however,theirintensityisnegligiblylowllj.AlthoughUVradiationisaminorpartofthesolarspectrum,itisconsideredtobeveryeffective.Basedondifferencesinbiologicalresponses,UVradiationissubdividedintothreewavebands:UVC(100urn--280"m),UVB(180urn--320urn)andUVA(320urn--400"m)[ZJ.Inthisstudy,cytotox…     

体外观察维甲酸对NIH/3T_3细胞的抑制作用

目的　评价维甲酸 (RA)对NIH/3T3 细胞生长的影响。方法　体外观察 5种浓度RA对NIH/3T3 细胞生长的作用。结果　 5种浓度的RA均能抑制NIH/3T3 细胞的生长 ,且随着浓度的升高 ,RA抑制细胞增殖的作用增强。结论　RA能抑制NIH/3T3 细胞的增殖     

MTT法检测博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度和时间的博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞（NIH3T3细胞）增殖的影响。方法：取对数生长期的NIH3T3细胞,用10%胎牛血清培养制成的细胞悬液加入96孔培养板中培养。以NIH3T3细胞为观察对象,分别给予不同浓度（0.1~10 000 mU/mL）博莱霉素处理,于给药后12 h、36 h、48 h后采用4-甲偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。结果：与空白对照组比较,1~10 mU/mL浓度的博莱霉素,可促进NIH3T3细胞增殖（P〈0.05）。其余浓度博莱霉素对细胞增殖无影响。结论：1~10mU/mL浓度的博莱霉素能够促进NIH3T3细胞的增殖。     

稳定表达Trop-2基因的NIH3T3细胞系的构建和特性分析

目的:建立稳定表达人滋养层细胞表面抗原(Trop-2)NIH3T3细胞,分析过表达Trop-2对NIH3T3细胞的生长?增殖和侵袭特性的影响?方法:将Trop-2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,转染NIH3T3细胞,通过G418筛选及RT-PCR鉴定获得稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞(NIH3T3-Trop-2)?用MTS法检测NIH3T3-Trop-2细胞的增殖能力,软琼脂集落形成实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的克隆形成能力,明胶酶谱法检测NIH3T3-Trop-2细胞的基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌及细胞划痕实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的迁移能力?结果:稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞在生长增殖?克隆形成及侵袭能力均较NIH3T3细胞强,细胞培养上清中的MMP-2和MMP-9增多?结论:Trop-2对细胞的增殖与迁移能力具有明显的促进作用?     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

稳定表达NT-3的NIH3T3细胞对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响

目的通过体外共培养观察NT-3对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响.方法建立能够稳定表达、分泌NT-3蛋白的NIH3T3细胞系;选择出生2～4 d的BALA/CA小鼠,进行耳蜗螺旋神经节细胞原代培养并分为3组,其中Ⅰ组与稳定分泌NT-3的NIH3T3细胞共培养,Ⅱ组与传染空载体NIH3T3细胞共培养,Ⅲ组与NIH3T3细胞共培养,共培养2周后,观察各组螺旋神经节细胞的数量及轴突长度的变化.结果共培养2周后,与对照组相比,NIH3T3-NT-3共培养组SGC的数量以及突起的长度均显著高于对照组.结论NT-3可显著减轻耳蜗螺旋神经节神经的退行性改变.     

丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

受体介导甲胎蛋白对NIH3T3细胞增殖的促进作用

目的:探讨甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)促新生细胞增殖作用的分子机理。方法:从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的NIH3T3细胞;用3H-TdR参入法观察AFP对细胞DNA合成的影响以及放射受体分析法分析NIH3T3细胞膜表面AFP受体分布;观察在AFP作用下细胞内的第二信使物质环磷酸腺苷(cAMP)浓度及依赖cAMP激活的蛋白激酶A(PKA)活性的改变;Westernblot分析AFP对增殖相关的P21ras表达的影响。结果:10～80mg/L的AFP对NIH3T3细胞的DNA合成有明显的促进作用,与对照组比较最大增幅为121.9%;在NIH3T3细胞膜表面存在2种不同解离平衡常数(KD)的AFP受体,KD1=2.722nmol/L(12810位点/细胞);KD2=89.305nmol/L(119700位点/细胞);AFP能显著提高NIH3T3细胞内的cAMP浓度及PKA活性;对P21ras的表达也有明显的促进作用。结论:AFP促NIH3T3细胞增殖是通过细胞膜表面受体介导,经跨膜cAMP-PKA信号转导途径,影响基因表达来实现的。     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.