非结核分枝杆菌病的实验室诊断技术进展

目前,非结核分枝杆菌（NTM)病的发病率在全球逐年提高,NTM与结核分枝杆菌均可引起肺部以及其他部位病变,而且临床症状相似,鉴别诊断困难,所以分枝杆菌菌种鉴定对于疾病的诊断、治疗及预后意义重大。传统生化鉴定方法费力耗时,不能很好地满足临床需要。近年来,以免疫层析技术为基础的MPB64抗原胶体金法、以色谱技术为基础的气相及高效液相色谱法、以基因探针、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）及PCR-基因测序方法为代表的分子生物学技术等各种新技术的引入,为NTM的菌种鉴定提供了更为科学的方法。作者就上述3种技术为基础开展的菌种鉴定方法,综合国内外近年来的文献,介绍了各种方法的原理、应用情况、性能指标等,同时对方法的优点及局限性进行初步评价。相信随着新技术不断完善,能够逐步形成快速可靠、成本低廉的标准化NTM菌种鉴定体系。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测临床标本结核分枝杆菌DNA

目的比较二聚体蝎型探针荧光定量PCR与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）的检出率、检测时间等，探讨二聚体蝎型探针荧光定量PCR检测临床标本中结核分枝杆菌DNA（T＆DNA）的实际应用价值。方法以建立的结核二聚体蝎型探针荧光定量PCR方法为基础，对43例结核确诊患者的标本及11例非肺结核患者的痰标本进行检测，并与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）进行比较。结果二聚体蝎型探针荧光定量PCR能快速准确的检测临床标本中的TB-DNA。其标准品浓度在10^2～10^6copies／μl时，方法能够保持良好的线性关系（相关系数为0．9994），阳性检出率（100％）显著高于抗酸染色法（16．28％）和培养法（37．21％）的检出率，与MTD试验的检出率（100％）一致。MTD试验检测时间约4～5h，而二聚体蝎型探针FQ-PCR检测约需80min即可得到检测结果，检测费用仅为MTD的1／4。结论二聚体蝎型探针荧光定量PCR用于临床标本结核分枝杆菌DNA的检测具有快速价廉、敏感特异的特点，该方法作为定量检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径值得临床推广应用。     

应用DNA探针直接检测结核分枝杆菌DNA

由于ＤＮＡ探针杂交反应特异性高 ,国内外研究者已采用ＤＮＡ探针杂交技术检测结核分枝杆菌。但该检测方法敏感性较低 ,通常采用与聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增相结合的方法。但这样增加了实验的费用和交叉污染的机会。我们在对ＤＮＡ探针与ＰＣＲ结合检测临床标本进行系统研究的基础上 ,发现临床标本简化法处理 ,即ＤＮＡ探针化学发光检测 ,ＤＮＡ损失较少 ,还可提高检测的敏感性 ,现将结果报道如下。材料与方法一、菌种来源受试分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所。二、标本收集结核患者痰标本 2 31份 ,血液标本 85份 ,脑脊液、胸、…     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

结核分枝杆菌耐药性检测专家共识

耐药结核病尤其是耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)是目前临床亟待解决的难题之一,而对抗结核药物进行药物敏感性试验(DST)可为耐药结核病的诊断提供实验室依据。本专家共识简要地介绍了我国临床常用的结核分枝杆菌(MTB)DST方法(包括表型DST和分子DST);提出了MTB耐药性检测策略和正确判读检测结果的建议;指出目前DST检测技术和临床应用存在的问题,并对未来DST的发展前景进行了展望。     

结核分枝杆菌IS6110探针的克隆化

目的 制备克隆化结核分枝杆菌IS6110探针。方法 将IS6110的PCR扩增245bp片段克隆至质粒载体pCR2.1中。结果 得到了含有IS6110克隆化245bp的质粒菌析。结论 克隆化的探针易操作且一致性较好。     

PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究

目的 评价PCR-荧光探针法快速检测Mtb和非结核分枝杆菌（NTM）的临床应用价值。方法 应用分枝杆菌核酸检测试剂对1015 例痰标本和56株临床分离株进行检测,与Mtb核酸扩增（PCR）荧光（目前临床上认可惟一同类产品）检测结果进行比较。采用SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理,采用χ²检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 PCR-荧光探针法检测痰标本分枝杆菌灵敏度50.3%（373/741）,特异度98.9%（271/274）;菌阳肺结核标本检测灵敏度97.0%（257/265）,菌阴肺结核标本检测灵敏度24.4%（116/476）;1015份痰标本中检测出11例非结核分枝杆菌（NTM）核酸阳性标本（占1.1%）,经16S rDNA 测序确认,准确率100.0%。随机数字量表法抽取138例标本重复进行第2次检测,符合率100.0%。对56株临床分离株（1株Mtb临床分离株,55株NTM临床分离株）检测,准确率100.0%。对临床需要的226份标本同时与达安公司试剂盒检测结果比较,总体符合率95.1%（215/226）,经统计学分析,两者之间差异无统计学意义（χ²=2.98,P=0.226）。结论 PCR-荧光探针法可快速检测和区分痰标本Mtb与NTM,具有临床推广应用价值。     

噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌标准化研究

目的　对噬菌体生物扩增法快速检测和鉴别标本中分枝杆菌的方法学进行探讨。方法　对噬菌体生物扩增法的条件 :感染时间、杀灭胞外噬菌体的药物浓度和时间进行探讨和比较 ;观察不同分枝杆菌应用此法的检测灵敏度和特异性 ,以及对呼吸道常见细菌的特异度 ;观察实验中所用噬菌体、杀菌剂、辅助细菌在 2 8～ 4 0周内的稳定性。结果　 (1)结核分枝杆菌与噬菌体感染 3～ 4h时感染效率较高 ,4 %硫酸亚铁胺 10 0 μl作用 5min能全部杀灭 1 1ml中 1× 10 9噬菌斑形成单位(PFU)的噬菌体 ;(2 ) 80～ 2 0 0集落形成单位 (CFU) /ml的结核分枝杆菌活菌能用此法检测出阳性结果 ,非结核分枝杆菌≤ 1× 10 3 CFU/ml时仅耻垢分枝杆菌出现阳性结果 ,特异性为 95 % ,而≥ 1× 10 4CFU/ml时结果依据不同的菌株而不同 ,呼吸道常见的非分枝杆菌细菌用此法的检测特异性为 10 0 % ;(3)液体 4℃保存实验中的主要成分 ,稳定性均较好。结论　应用噬菌体方法可以快速检测和鉴别结核分枝杆菌 ,所需试剂的稳定性较好 ,为广泛应用于临床检测提供了依据。     

噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌方法学研究

目的建立噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌试验方法,探讨最佳检测条件.方法应用分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌,比较各种检测条件对测定结果的影响,并将所建方法用于痰标本检测,结果与BIOTEC Lab公司产品比较.结果 1×109噬菌斑形成单位(PFU)/ml的噬菌体,37℃感染 60 min可检出200～500条/ml结核分枝杆菌.杀毒剂100 mmol /ml,室温作用5 min可完全灭活受试噬菌体.指示细胞浓度在1×108条/ml 时,形成的噬菌斑清晰,便于计数.加热灭活的细菌和指示细胞不被噬菌体感染.H37Rv、H37Ra和牛分枝杆菌参考菌株检测结果均为阳性,7种非分枝杆菌和16种常见非结核分枝杆菌检测结果为阴性,4种非结核分枝杆菌(偶然、胞内、金色、草分枝杆菌)在高浓度时(>1×105条/ml)检测结果为阳性.重复试验结果表明,本法批间和批内变异系数均<15%.痰标本氢氧化钠-半胱氨酸液化方式的阳性检出率为94%(49/52),显著高于氢氧化钠液化结果的62%(32/52,χ2＝15.06,P<0.01);预培养1 d的阳性检出率为65%(51/78),显著高于未预培养结果的40%(31/78,χ2＝18.05,P<0.01).临床标本检测结果表明,我们的试剂与进口试剂检测结果基本相同.结论噬菌体生物扩增法快速、简便、灵敏,有助于结核分枝杆菌的快速检测,但是测定条件的选择极为重要.     

四种结核分枝杆菌检测方法临床诊断效能的评价

目的 评估痰涂片抗酸染色镜检(简称“涂片法”)、L-J培养基(Lowenstein-Jenden medium)固体培养(简称“L-J法”)、BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960法”)及GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert法”)等4种结核分枝杆菌检测方法检出结核病病原菌的能力。方法 搜集2018年1月1日至2018年12月31日北京结核病控制研究所451例疑似肺结核患者的痰标本,同时使用涂片法、L-J法、MGIT 960法及GeneXpert法进行检测。对上述4种方法的检测结果以临床诊断情况(总体分为“肺结核患者”与“非肺结核患者”)为参考标准,计算各种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率;同时计算4种方法联合检测结果的病原学阳性率(其中任何一种方法检测结果为阳性,即判断为联合检测结果为阳性)。结果 451例疑似肺结核患者中,临床最终诊断依据《WS 288—2017肺结核诊断》标准进行,诊断为肺结核患者227例(肺结核225例、肺结核并发结核性胸膜炎2例),非肺结核患者224例[非结核分枝杆菌(NTM)肺病11例,陈旧性肺结核6例,肺部阴影待查181例,胸腔积液3例,肺纤维化1例,肺炎3例,肺癌1例,密切接触者筛查18例]。以临床诊断结果为参考标准,涂片法、L-J法、GeneXpert法、MGIT 960法检测敏感度分别为22.5%(51/227)、32.2%(73/227)、37.9%(86/227)、43.2%(98/227),特异度分别为96.0%(215/224)、96.4%(216/224)、100.0%(224/224)、95.1%(213/224),一致率分别为59.0%(266/451)、64.1%(289/451)、68.7%(310/451)、69.0%(311/451)。涂片法和L-J法联合检测,以及涂片法、L-J法和GeneXpert法联合检测,4种方法联合检测的敏感度分别为34.8%(79/227)、43.6%(99/227)、49.8%(113/227),特异度分别为96.0%(215/224)、96.0%(215/224)、93.8%(210/224),一致率分别为65.2%(294/451)、69.6%(314/451)、71.6%(323/451)。结论 以临床诊断为参考标准,MGIT 960法检测的敏感度最高;GeneXpert法检测的特异度最高;4种方法联合检测能够显著提高诊断敏感度,与临床诊断的一致率也显著提高。     

新型胶颗粒芯片技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究

目的 评估一种新型胶颗粒芯片技术[TruArray胶颗粒芯片(Gel element arrays),简称为“TruArray芯片”]用于痰标本中结核分枝杆菌及利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的检测效能。 方法 选取2016年8月在首都医科大学附属北京胸科医院就诊的149例疑似肺结核患者痰标本,分别进行涂片镜检、BACTEC MGIT 960快速液体培养系统(简称“MGIT 960”)、TruArray芯片和GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测,对液体培养阳性菌株进行测序菌种鉴定、MGIT 960药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和耐药相关基因测序,分析TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的检测效能。 结果 液体培养、GeneXpert和TruArray芯片对结核分枝杆菌的检出率分别为32.2%(48/149),53.7%(80/149)和57.0%(85/149),TruArray芯片和GeneXpert两种方法检出率差异无统计学意义(χ ²=0.34,P=0.560),但TruArray芯片检测阳性率高于液体培养(χ ²=18.59,P<0.01)。以MGIT 960试验结果为标准,TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.9%(47/48)和61.4%(62/101);以GeneXpert检测结果为标准,TruArray芯片检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.5%(78/80)和88.4%(61/69)。以MGIT 960药敏试验结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度分别为91.7%(11/12)和96.8%(30/31);以GeneXpert检测结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度为85.0%(17/20)和97.9%(47/48);以耐药基因测序结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度分别为92.3%(12/13)和100.0%(30/30)。以MGIT 960液体药敏试验结果为标准,TruArray芯片技术检测INH耐药的敏感度和特异度分别为78.6%(11/14)和93.8%(30/32);以耐药基因测序结果为判断标准,TruArray芯片检测INH耐药的敏感度和特异度分别为100.0%(11/11)和94.3%(33/35)。 结论 TruArray芯片检测技术快速、可靠,在结核病及耐多药结核病快速诊断方面具有非常好的应用前景。     

Establishment and effect evaluation of polymerase spiral reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis

目的 建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法 针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2×反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果 通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10³菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论 PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。     

结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价

目的 建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果。方法 针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测。提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入Bst DNA聚合酶的RM2×反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45min,通过荧光信号进行检测。通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估。于2019年5—8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测。以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能。结果 通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到10³菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应。200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0%(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5%(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5%(87/200)。以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4%(80/83)、94.0%(110/117),阳性预测值为92.0%(80/87),阴性预测值为97.3%(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898)。结论 PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查。     

胶体金法结合涂片形态学特征快速鉴别结核分枝杆菌复合群的应用评价

目的 探讨结核分枝杆菌抗原胶体金法结合涂片形态学特征鉴别结核分枝杆菌复合群的应用价值。 方法 采用涂片形态学特征和结核分枝杆菌抗原胶体金法对853株分枝杆菌临床分离株进行鉴别并与传统菌种鉴定结果进行比较。 结果 涂片法鉴别结核分枝杆菌的敏感度为98.4%(750/762),特异度为96.7%(88/91);胶体金试验鉴别结核分枝杆菌的敏感度为99.0%(754/762),特异度为98.9%(90/91);两种方法均为阳性,可报告菌株中含有结核分枝杆菌复合群(MTC),其阳性预测值为100.0%（741/741）;两种方法均为阴性,可报告非结核分枝杆菌(NTM),其阴性预测值为100.0%（87/87）。 结论 结合涂片形态和结核分枝杆菌抗原胶体金两种方法鉴别结核分枝杆菌可以提高检测的准确性,是一种快速、简便,适于各级实验室使用的方法。     

新型分子检测技术在基层实验室诊断肺结核的效能分析

目的 分析与比较GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)与交叉引物核酸恒温扩增(cross-priming amplification,CPA)技术在基层实验室结核病快速诊断中的效能。 方法 连续收集黑龙江省五常市结核病防治所2014年4月至2017年7月初诊肺结核可疑患者的痰标本,分别进行改良罗氏固体培养基培养法(简称“固体培养法”)与快速分子检测 (A组采用GeneXpert检测了787例;B组采用CPA检测了501例)。以固体培养法为标准,计算2种分子检测技术的敏感度、特异度、Kappa值。结果 A组共检测787例患者痰标本,其中培养阳性229例,GeneXpert阳性300例,GeneXpert检测的敏感度、特异度分别为99.1%(227/229)、86.9%(485/558),Kappa=0.788。B组共检测501例患者痰标本,其中培养阳性129例,CPA检测阳性125例。CPA检测的敏感度、特异度分别为81.4%(105/129)、94.6%(352/372),Kappa=0.768。2种分子检测技术与固体培养法检测结果的一致率比较,差异无统计学意义[90.5%(712/787)vs 91.2%(457/501); χ ²=0.204, P=0.652)]。结论 CPA检测的准确性与GeneXpert相当,但其成本低、无需检测仪器、允许每批次大量样本同时操作,更适用于基层实验室对肺结核患者的早期诊断。     

结核病诊断技术的研究进展

结核病是危及我国人们的重大传染病之一,根据 WHO 的统计,我国是全球22个结核病疫情严重的国家之一,同时也是全球27个耐多药结核病严重的国家之一,对结核病的早期诊断规范治疗与控制耐药结核,是降低结核发病率的有效措施,由于临床表现不典型潜伏性结核感染及结核耐药问题,导致我国的结核疫情防控形势依然严峻,实验室检查是诊断结核的重要手段常用的实验室诊断,技术包括 PPD,结核抗体,细菌学检测方法,结核分枝杆菌感染 T 淋巴细胞斑点试验(T-SPOT),病理学检测,气管镜检查,分子生物学检测方法,免疫学检测方法等,各种技术在诊疗过程中,各有优缺点,在诊疗过程中,我们能利用检查手段的每个特点进行有效的诊断,需要考虑的重要因素,尽早正确的治疗督导用药,使结核病的疫情得以控制。