类风湿关节炎患者外周血T细胞抑制性多肽的研究

目的探讨HLADRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308317变构肽对类风湿关节炎(RA)患者外周血T细胞激活的影响。方法选取27例HLADRB1阳性的RA患者,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。采用固相法合成HA308317变构肽,并检测RA患者外周血T细胞对这些多肽的反应性;及多肽对白细胞介素(IL)2、γ干扰素分泌及CD69表达的影响。同时进一步观察HA308317变构肽对CII263272或HA308317多肽介导的T细胞激活的抑制作用。结果变构肽刺激T细胞增殖的阳性率分别为7.4%(APL1)、3.7%(APL2)和3.7%(APL3),明显低于CII263272和HA308317原型肰(62.2%和52.9%),3条变构肽的刺激指数也明显低于原型肽(均P<0.01)。并且,其诱导IL2、γ干扰素分泌的水平及CD69的表达亦下降(P<0.05)。与单独加入CII263272或HA308317原型肽的对照组相比,加入HA308317变构肽的T细胞增殖的刺激指数明显下降(P<0.05)。结论替换HA308317多肽中T细胞受体的接触残基产生了弱或非T细胞刺激肽,它们可能有效地抑制RA的T细胞免疫反应。     

Ⅱ型胶原多肽263～272序列中多个氨基酸替换的意义及其在胶原性关节炎治疗中的作用

目的:研究Ⅱ型胶原变构肽(APL)中氨基酸替换对胶原性关节炎(CIA)的抑制作用,为类风湿关节炎(RA)的多肽免疫治疗提供试验依据.方法:以丙氨酸替换Ⅱ型胶原(CⅡ)263～272多肽中与T细胞受体(TCR)结合的氨基酸,3H掺入法检测变构肽对RA患者外周血T细胞活化的竞争抑制作用,筛选用于CIA治疗的变构肽.以牛CⅡ诱导大鼠CIA模型,应用不同剂量(1, 10, 100 μg)的CⅡ变构肽每周2次皮下注射,观察大鼠关节肿胀的变化情况.治疗3周后(初次免疫后第35天)处死大鼠,进行X线及病理评分.ELISA法检测血清IFN-γ水平.结果:3条CⅡ263～272变构肽均不同程度抑制CⅡ原型肽对RA患者T 细胞的活化.其中,同时替换267位谷氨酰胺(Q)、270位赖氨酸(K)和271位甘氨酸(G)为丙氨酸(A)的APL3效果最好.应用APL3对CIA进行治疗的结果发现,100 μg治疗组CIA大鼠的关节炎指数、X线及病理评分均显著低于PBS对照组.血清IFN-γ水平也较PBS对照组明显下降.而无关肽组与PBS对照组相比,关节炎指数、X线和病理评分以及血清IFN-γ水平均无明显差别.结论:TCR结合氨基酸位点替换后的CⅡ263～272多肽具有T细胞低反应性和对原型肽的竞争抑制作用,并可抑制大鼠胶原性关节炎的发展,提示其抑制RA免疫异常的可能性.     

三七总皂苷对类风湿关节炎患者CCP/AST增殖及分泌INF-γ的影响

[目的]观察三七总皂苷(PNs)对类风湿关节炎(RA)患者环瓜氨酸肽(CCP)抗原特异性T细胞(CCP/AST)体外增殖及分泌干扰素-γ(INF-γ)的影响.[方法]体外分离培养24例RA患者外周血淋巴细胞,分为空白对照组、CCP组、甲氨喋呤(MTX)对照组及PNS组.体外培养72 h后,采用CCK-8法测定T细胞增殖...     

HLA-A2限制性CTL表位HPV18E7_(7-15)分子修饰肽的免疫原性鉴定

目的:对HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位HPV18E77-15进行氨基酸置换修饰,探讨修饰肽的免疫原性。方法:采用细胞毒实验(51Cr释放法),以包被了九肽的T2细胞作为靶细胞,以九肽诱导的HLA-A2阳性人外周血单个核细胞为效应细胞,观察目标肽是否具有诱导特异性CTL杀伤效应。结果:修饰肽符合HLA-A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论:修饰肽具有较强的抗原性,可以作为高危型HPV感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。     

HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的预测与鉴定

目的:初步鉴定人乳头瘤病毒18型E7抗原的HLA-DRB1*0301限制性辅助T淋巴细胞(T-HelperCell)表位。方法:用SYFPEITHI软件预测HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位,候选表位分别命名为P1、P2、P3,以固相多肽合成技术合成,并运用HPLC进行纯化和质谱法(MS)鉴定。以密度梯度法分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC),合成肽刺激PBMC,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测淋巴细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞表型。结果:多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激PBMC后能够有效诱导CD4 T淋巴细胞增殖。结论:P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th细胞表位。     

类风湿关节炎患者HLA-DR4/1表型与流感病毒血凝素特异性T细胞增殖及其抗体的关系

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者人类白细胞抗原(HLA)-DR4/1表型与流感病毒血凝素(HA)308-317多肽特异性T细胞增殖和血清抗HA308-317抗体之间的关系.方法 将HA308-317多肽与70例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育5 d,3H掺入法测定T细胞增殖.用ELISA法检测RA患者血清HA308-317抗体水平.以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR.SSP)技术对RA患者进行HLA-DR分型.结果 在70例RA患者中,27例HLA-DR4/1表型阳性.其中,HA308-317多肽可刺激T细胞增殖的RA患者有17例(62.9%),10例无反应性;15例(55.6%)HLA-DR4/阳性RA患者抗HA308-317抗体阳性.在HLA.DR4/I表型阴性的RA患者中,T细胞对HA308.317多肽有反应性者10例(23.3%),无反应性者33例;25例(58.1%)患者抗HA308-317抗体阳性.HLA-DR4/1表型阳性组HA308-317特异性细胞增殖高于HLA-DR4/1表型阴性组(P＜0.01),但两组血清中HA308-317抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RA患者HA308-317特异性T细胞增殖与HLA-DR4/1表型有关,HA308-317抗体生成与HLA-DR4/l亚型无明显关系;HA308-317多肽可能通过诱导HLA-DR4/1特异性T细胞活化参与RA的发病.     

CD40配体刺激人外周血来源B细胞的长期培养及增殖活化

目的 建立外周血来源B细胞体外长期培养体系,观察培养过程中B细胞的增殖活化及抗原提呈功能.方法 利用重组人可溶性CD40配体(sCD40L)刺激人外周血B细胞的长期培养过程中,流式细胞技术检测B细胞DNA周期及B细胞表面CD80、CD86、主要组织相容复合物(MHC)Ⅰ类及Ⅱ分子的表达状况;观察B细胞增殖情况及B细胞活化后表面分子的表达.采用乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)-异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗原多肽与B细胞共孵育,检测B细胞对抗原多肽的负载能力.结果 人外周血B细胞在sCD40L培养体系中可长期培养达50 d,在此期间,B细胞绝对计数增加近10倍,外周血B细胞比例由8.21%增高到70.67%,活化的B细胞高表达CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,并可负载HBV核心抗原肽.结论 sCD40L培养体系可在体外长期培养人外周血B细胞,并使B细胞增殖活化,具有抗原提呈细胞的特征.     

类风湿关节炎患者瓜氨酸化Ⅱ型胶原的T细胞增殖反应和抗体生成

目的 研究类风湿关节炎(RA)患者对瓜氨酸化Ⅱ型胶原(Cit-CⅡ)的T细胞增殖反应和抗体生成,探讨Cit-CⅡ在RA发病机制中的作用.方法 体外用肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化牛CⅡ中的精氨酸转变为瓜氨酸,生成Cit-CⅡ,用3H掺入法检测34例RA患者和18例对照者(包括6例骨关节炎患者和12名健康志愿者)的外周血单个核细胞(PBMC)对CⅡ和Cit-CⅡ的增殖反应,用酶联免疫吸附试验测定患者和对照者血清抗CⅡ抗体及抗Cit-CⅡ抗体水平.结果 RA患者的PBMC对CⅡ和Cit-CⅡ的增殖反应阳性率分别为35.3%(12/34)和32.4%(11/34),均分别高于对照组11.1%和0(均P<0.05).RA患者的PBMC对Cit-CⅡ增殖反应阳性率与对CⅡ增殖反应阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05).RA患者抗Cit-CⅡ抗体阳性率(52.9%,18/34)高于抗CⅡ抗体阳性率(32.4%,11/34).CⅡ增殖反应阳性组抗CⅡ抗体的阳性率(58.3%,7/12)高于增殖反应阴性组(18.2%,4/22),Cit-CⅡ增殖反应阳性组抗Cit-CⅡ抗体的阳性率(72.7%,8/11)高于增殖反应阴性组(43.5%,10/23),差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 抗Cit-CⅡ抗体在RA中有很高的特异性;RA患者抗CⅡ抗体的生成可能与CⅡ特异性T细胞介导的B细胞活化有关.但是Cit-CⅡ并没有比原型CⅡ引起RA患者更强的外周血T细胞增殖反应,Cit-CⅡ在RA细胞免疫发病中的作用仍需进一步研究.     

人类白细胞抗原-DRβ1特异性低T细胞反应性肽对T细胞激活的抑制作用

目的　研究人类白细胞抗原 (HLA) DRβ1特异性Ⅱ型胶原 (CII)多肽的T细胞受体(TCR)结合表位改变对T细胞激活的影响。探讨通过抑制T细胞对抗原肽的识别治疗类风湿关节炎的新途径。方法　利用AutoDock3 0系统设计非T细胞结合肽 ;以激光共焦显微镜及流式细胞仪观察荧光标记的CⅡ 2 6 3 2 72修饰肽的细胞内转运及其在细胞膜上的表达 ;应用HLA DR1转基因抗原呈递细胞和特异性T细胞的激活体系 ,研究替换TCR识别氨基酸的CII修饰肽在T细胞激活中的作用。结果　计算机模拟显示CII第 2 6 3位苯丙氨酸 (F)、2 6 6位谷氨酸 (E)是与HLA DR1结合的关键位点 ,而 2 6 7位谷氨酰胺 (Q)、2 6 9位脯氨酸 (P)和 2 70位赖氨酸 (K)是T细胞识别的主要功能氨基酸。用甘氨酸 (G)、和 /或丙氨酸 (A)替换上述位点可去除功能性侧链。CⅡ修饰肽可被HLA DR1转基因抗原呈递细胞摄取并与膜表面的HLA DR1分子结合。CⅡ 2 6 3 2 72原型肽可激活T细胞 ,而用A或G单一替换 2 6 7、2 6 8、2 6 9、2 70位氨基酸或连续替换 2 6 8 2 70位氨基酸的修饰肽对T细胞的激活能力明显降低 (P <0 0 1)。低反应性修饰肽 2 70A、sub2 6 8 2 70对CⅡ诱导的T细胞激活有显著抑制作用。结论　通过替换CII中TCR特异性氨基酸可减弱或消除其对T细胞的结合能力及激     

汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定

目的：鉴定汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNVNP)C-端T细胞表位,为肾综合征出血热(HFRS)发病机制、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究奠定基础．方法：采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS恢复期患外周血单个核细胞(PBMC),用IFN-γELISPOT实验和T细胞增殖实验,测试7例患：PBMC对23条NPC-端合成多肽的T细胞应答．结果：IFN-γELISPOT实验结果表明,2名供体(3、4)可分别检测到对51、70号2条多肽特异性T细胞应答．在供体3,70号肽特异性T细胞频率为45SF(y10E6I,BMC：在供体4,51号肽特异性T细胞频率为82SFC／10E6PBMC。T细胞增殖实验与ELISPOT结果基本一致,但53号肽和64号肽还可分别刺激供体1和供体4的T细胞增殖,而未能诱导IFN-γ分泌．结论：51号和70号多肽可能是NPC-端较强的T细胞表位．     

类风湿关节炎患者Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及抗体生成与HLA-DR4的关系

目的　探讨类风湿关节炎(RA)患者Ⅱ型胶原 (CⅡ)特异性T细胞增殖和CⅡ抗体生成,及与人类白细胞抗原(HLA)- DR_4亚型之间的关系。方法　将CⅡ263 -272十肽与 62例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育 5d,应用四甲基偶氮唑盐法测定T细胞增殖。酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定患者血清CⅡ抗体水平。提取 40例患者外周血基因组DNA,以 33种HLA- DR_4等位基因亚型的特异引物PCR扩增后测定患者HLA DR分型情况。结果　在 62例RA患者中, 38例(61 .3% )患者的T细胞在加入CⅡ263- 272后出现明显增殖,CⅡ263 -272抗体阳性率为 53. 2%。细胞增殖反应阳性的患者CⅡ263- 272抗体的阳性率为 66. 7%,增殖反应阴性的患者为 34 6%,两者比较P<0 .05。CⅡ263 -272抗体阳性的患者T细胞增殖反应率为 69 7%,阴性患者为 42 .1%, 两者比较P<0 .05。所有患者T细胞增殖刺激指数 (SI)与CⅡ263- 272抗体浓度呈显著正相关 (r=0 68,P<0. 01)。40例患者HLA分型中,有 16例携带HLA -DR_4等位基因,未发现HLA DR_4与CⅡ特异性T细胞增殖反应、CⅡ抗体阳性有显著相关性。结论　CⅡ抗体的生成可能与CⅡ特异性T细胞介导的B细胞活化有关。     

类风湿关节炎患者HLA-DR4/1亚型与抗环瓜氨酸肽抗体的关系

[目的]探讨类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者HLA—DR4／1分子与血清抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide,CCP）抗体之间的关系。[方法]收集118例RA患者,以序列特异性引物聚合酶链反应（PCR—SSP）技术对上述患者进行HLA—DR4／1分型,酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测患者血清抗CCP抗体水平。[结果]在118例RA患者中,35例患者HLA—DR4阳性,其中DRB1^＊0405阳性20例;5例患者HLA—DR1阳性。在118例RA患者中,抗CCP抗体阳性有90例。其中,在40例HLA—DR4／1 阳性的RA患者中,抗CCP抗体阳性的占82．5％（33／40）;在其余78例HIA—DR4／1阴性RA患者中,73．1％（57／78）抗CCP抗体阳性。HLA～DR4／1阳性患者与HLA—DR4／1阴性患者抗CCP抗体的阳性率差异无统计学意义（P=0．255）。而20例HLA—DRB1^＊0405阳性的RA患者抗CCP抗体阳性者19例,HLA—DRB1^＊0405阳性RA患者抗CCP抗体阳性率高于其他HLA—DR4／1亚型阳性的RA患者,也高于HLA—DR4／1阴性患者。[结论]RA中HIJA—DRB1^＊0405基因与抗CCP抗体具有一定的相关性。     

类风湿关节炎患者人类白细胞抗原-DR4/1表型与Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及血清Ⅱ型胶原抗体的关系

目的:探讨类风湿关节炎 (RA) 患者HLA-DR4/1表型与Ⅱ型胶原 (CⅡ) 263-272 多肽特异性T细胞增殖和血清CⅡ263-272抗体之间的关系. 方法:将CⅡ263-272多肽与70例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育5天,用3H参入法测定T细胞增殖,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者血清CⅡ263-272抗体水平.以序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术对上述患者进行HLA-DR分型.结果:在70例RA患者中,27例HLA-DR4/1表型阳性,43例HLA-DR4/1表型阴性.在HLA-DR4/1表型阳性的RA患者中,CⅡ263-272多肽可刺激T细胞增殖的有15例(55.6%),12例(44.4%)呈无反应性;18例(66.7%) 患者抗CⅡ263-272抗体阳性.而在HLA-DR4/1表型阴性的RA患者中,T细胞对CⅡ263-272多肽有反应性者13例(30.3%),无反应性者30例(69.7%);15例(34.8%) RA患者抗CⅡ263-272抗体阳性.HLA-DR4/1表型阳性组CⅡ263-272特异性细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成均高于HLA-DR4/1表型阴性组.结论:RA 患者CⅡ263-272 特异性T细胞增殖和CⅡ263-272抗体生成与HLA-DR4/1表型有关.     

隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究

目的探讨纯化的隐球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）免疫应答的能力,为新型隐球菌疫苗的研制打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的GMFDGLSGV单体、二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多聚体的免疫原性。结果10例HLA-A＊0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07;增殖反应明显高于四聚体（平均SI为20.1±1.37）、二聚体（平均SI为14.1±1.06）、单体（平均SI为11.4±0.68）以及阴性对照（平均SI为1±0.10）引起的细胞增殖反应（P〈0.01）。在抗原肽诱导的CTL细胞毒活性中,HLA-A＊0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照组均表现不同程度的杀伤活性,平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1（P〈0.01）。结论本研究得到的重组优化八聚体具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的隐球菌疫苗打下了基础。     

A hepatitis C virus (HCV) core protein derived peptide inhibits HCV specific lymphocyte proliferation

T helper lymphocytes are important regulatory cells for the immune response in chronic hepatitis C. They recognize peptides, which are generated from the viral proteins by antigen processing and are bound to MHC (major histocompatibility complex) class II molecules. However, antigen processing might also result in non-immunogenic peptide fragments that can modify T cell activation. - To identify such peptide fragments in hepatitis C, we studied binding of 15 synthetic HCV core derived peptides to MHC class II molecules of 9 human homozygous typing B cell lines (HT-BCLs) as well as T cell proliferation in 41 HLA-typed patients with chronic hepatitis C. - We identified a peptide (HCV core aa 59-83) which bound to 7 HT-BCLs, whereas PBMC of only 2 out of 36 patients with the corresponding HLA-DR alleles proliferated in response to this peptide. Competition experiments indicated that small amounts of peptide aa 59-83 specifically inhibited the proliferative response to the recombinant core protein but not to core derived immunogenic peptides. Our data show that a peptide fragment from the HCV core region aa 59-83 can interfere in vitro with immune recognition of the HCV core protein.     

类风湿关节炎外周血和关节液树突状细胞的膜分子表达及功能研究

目的研究类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者树突状细胞（dendritic cell,DC）的膜分子表达水平和功能的变化,探讨DC在RA发病机制中的作用。方法应用流式细胞术、混合淋巴细胞培养测定诱导DC细胞表面分子表达、对同种异体T细胞功能情况,诱导成熟后DC表面分子表达与临床活动及预后相关指标ESR、CRP、RF、Stoke指数的相关性。结果RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD80、HLA—DR较正常人外周血来源DC增高（P〈0．05）,RA关节液来源DC较RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD86、CD80明显增高（P〈0．05）。RA关节液组较RA和正常人外周血DC对同种异体T细胞的刺激明显增强。RA患者外周血诱导成熟DC表型CD83、CD209与stoke评分指数呈正相关。结论提示RA时关节内免疫反应可能与局部DC分化、成熟能力增强有关,后者可通过激活T细胞引起自身免疫反应,造成滑膜组织损伤。RA患者DC表面共刺激分子表达水平的增高可能与患者免疫亢进及所致的免疫损伤有关。