应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3(STAT3)表达的抑制作用.方法 设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建STAT3 siRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染SW1990细胞,实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变.结果 PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功,分别转染SW1990细胞后,STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P＜0.05),其中,第二种STAT3 siRNA作用明显,可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63%和60%.结论 本研究构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达,为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础.     

STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用

目的 探讨STAT3基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌SW480细胞STAT3基因的干扰作用.方法 根据siRNA设计原则,构建靶向STAT3基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480),通过RT-PCR和 Western 印迹检测结肠癌SW480细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 pGPU6/GFP/STAT3重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确.质粒成功转染SW480细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05).结论 成功构建靶向STAT3基因的shRNA表达载体,转染SW480细胞,能有效抑制细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供前期的实验依据.     

丝裂原活化蛋白激酶特异性小干扰RNA表达载体对结肠癌细胞周期和DNA甲基化的影响

目的 构建丝裂原活化蛋白激酶（MEK）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体，观察其静默效应及对结肠癌细胞SW1116生长周期和DNA甲基化的影响。方法 选择MEK不同靶点寡核苷酸片段，克隆到pGCsilencer真核表达载体中。脂质体转染SW1116细胞，荧光显微镜评估转染效率，G418筛选稳定表达siRNA的细胞。Western印迹法检测siRNA对MEK蛋白表达的静默效果。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞生长活力，流式细胞术分析细胞周期，甲基化特异性PCR和DNA测序检测p16^INK4A基因启动子甲基化状态。结果 构建2个靶点的MEK重组质粒，分别转染和联合转染SW1116细胞，转染效率约为72．1％，G418筛选培养2周得到稳定表达MEK siRNA的细胞，MEK蛋白抑制率分别为74．2％和69．1％和90．2％，下游分子ERK蛋白磷酸化水平随之降低；细胞增殖活力下降2～4倍和细胞周期阻滞于G1期，细胞周期负调控冈子p16^INK4A启动子区呈低甲基化状态。结论 MEK特异性siRNA表达载体对结肠癌细胞MEK蛋白表达有一定的静默效果，多靶点联合效果更好，阻滞细胞周期于G1期，促进p16^INK4A基因去甲基化。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

RNAi沉默STAT3基因表达对Lewis肺癌细胞生长影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰技术沉默转录信号传导子与激活子家簇3（STAT3）对Lewis肺癌细胞凋亡、细胞生长抑制的影响。方法 应用真核细胞转染技术将Psilencer2.1-U6一siRNA—STAT3重组质粒转入小鼠Lewis肺癌细胞，同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照。于72h后收集细胞，分别提取细胞总蛋白及总RNA，分别用Western blot和RT—PCR测定STAT3基因在蛋白水平及mRNA水平的表达，用MMT法测定细胞的生长抑制状态，通过流式细胞仪检测Lewis肺癌细胞凋亡情况。结果 重组质粒明显抑制STAT3蛋白的表达、降低STAT3 mRNA水平并诱导Lewis肺癌细胞凋亡、使肿瘤细胞生长明显受抑。结论 Psilencer2.1-U6-siRNA—star3 Lewis转染肺癌细胞后，可有效抑制STAT3蛋白表达和STAT3 mRNA的表达，诱导Lewis肺癌细胞凋亡和肿瘤细胞生长抑制。     

pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

STAT3基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察信号转导与转录激活因子3（STAT3）基因表达沉默后对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响,探讨其机制.方法 构建靶向STAT3短发卡RNA（shRNA）表达载体,稳定转染胰腺癌SW1990细胞（SW1990-RNAi组）,以转染阴性对照shRNA表达载体细胞（SW1990-Con组）及亲本SW1990细胞（SW1990组）作为对照.应用蛋白质印迹法检测各组细胞STAT3、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）蛋白的表达.建立各组细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长,应用免疫组化法检测移植瘤的CD34表达,计算肿瘤的微血管密度（MVD）.结果 SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组细胞的STAT3蛋白表达量分别为84.69±9.31、82.00±7.76、7.93±1.24,VEGF蛋白表达量分别为82.94±8.97、80.86±10.28、39.04±6.23,MMP-2蛋白表达量分别为40.88±5.09、38.26±5.71、12.54±2.15,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值均＜0.05）,而SW1990-Con组与SW1990组细胞的3种蛋白表达量差异均无统计学意义.SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组裸鼠移植瘤的重量分别为（2.2±0.4）、（2.2±0.3）、（0.5±0.3）g,瘤组织的MVD分别为每高倍视野（20.35±2.41）、（18.79±1.94）、（9.62±1.06）个,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值＜0.05或＜0.01）,而SW1990组与SW1990-Con组间的差异均无统计学意义.结论 STAT3基因表达被抑制后SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长减缓,其机制可能是通过下调VEGF及MMP-2的表达、抑制肿瘤血管形成所致.     

STAT3调控胰腺癌侵袭转移相关基因的筛选

目的 应用基因芯片筛选信号转导与转录激活因子3(STAT3)调控胰腺癌侵袭转移的相关基因.方法 以慢病毒感染获得稳定STAT3沉默人胰腺癌细胞株SW1990,以空质粒病毒组、未感染组为对照.应用基因芯片筛选3组细胞与肿瘤侵袭转移相关的差异表达基因.用实时PCR及蛋白质印迹法检测STAT3 mRNA及蛋白表达,并验证所选取的3个差异表达基因(MMP-7、IL-1β、IgTα7).结果 靶向STAT3的病毒感染SW1990细胞后,STAT3 mRNA表达水平为0.391±0.037,显著低于空质粒病毒组的1.002±0.015和未感染组的1.206 ±0.042(P ＜0.05);STAT3蛋白表达水平为182.38±65.32,亦明显低于空质粒病毒组的223.40±58.40和未感染组的212.33±53.69(P＜0.05).STAT3沉默的SW1990细胞有8个肿瘤侵袭转移相关基因表达上调,3个表达下调,经验证,沉默组细胞MMP-7、IL-1β mRNA表达水平明显低于空质粒病毒组(0.287±0.115比1.010±0.124,t =19.45,P=0.000;0.490±0.010比1.002±0.002,t=13.83,P=0.000),而IgTα7 mRNA表达水平无明显变化(1.173±0.280比0.998±0.003,t=4.236,P=0.094).同时沉默组细胞MMP-7蛋白表达亦显著降低.结论 STAT3沉默可导致人胰腺癌SW1990细胞多个与肿瘤侵袭转移相关基因表达的改变,其中MMP-7可能是受STAT3调控的主要靶基因.     

弓形虫SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建编码弓形虫RH株膜表面蛋白1（SAG1）和微线体蛋白3（MIC3）的重组真核表达载体pcDNA3．1-SAG1-MIC3并鉴定，为弓形虫疫苗研制作准备。方法采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中分别扩增SAGl和MIC3基因片段。分别克隆人pMD18T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定；采用亚克隆技术将SAG1和MIC3基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），经含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组质粒pcDNA3．1-SAG1-MIC3，PCR、酶切和测序鉴定；采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞，经RT—PCR法检测转染细胞转录情况。结果MIC3和SAG1基因的TA-cloning经PCR和酶切鉴定，大小分别为933bp和789bp，与预期值一致；pcNDA3．1-SAG1-MIC3经酶切鉴定，目的片段约为1722bp．与SAG1MIC3长度相当；测定重组载体的核苷酸序列。与GenBank中的相应序列100％同源；PCR验证载体携带的SAG1-MIC3融合基因在Hela细胞中转录生成mRNA。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1SAG1-MIC3．为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

SMO基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对胰腺癌细胞SMO基因表达的影响

目的:Hegdehog信号通路在胰腺癌发生发展过程中发挥着重要的作用,针对其调控机制的研究将对胰腺癌发病机制的阐明奠定良好的理论基础.构建携带SMO靶向si RNA慢病毒表达载体,并证实其对胰腺癌细胞中SMO基因表达的抑制作用.方法:设计并合成3条SMO基因靶向si RNA片段,利用基因重组技术构建携带此3条片段的慢病毒表达载体并测定其滴度,构建好的慢病毒表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990后,采用RT-PCR法检测SMO基因的表达以筛选出效果最佳的干扰表达载体,并以此载体转染SW1990细胞后采用Western blot法检测SMO蛋白表达.结果:基因测序与酶切电泳结果提示成功合成SMO靶向siRNA片段且其正确插入慢病毒表达载体,无碱基缺失错排与突变,测定病毒滴度分别为5.31×10~8TU/m L,1.49×10~9TU/m L及8.50×10~8TU/m L,经转染SW1990细胞后,测定对SMO基因表达的抑制率分别为86.00%、74.85%及19.22%,效果最优的干扰表达载体转染SW1990细胞后对SMO蛋白表达的抑制率80%.结论:成功构建携带SMO基因靶向si RNA的慢病毒表达载体,且该载体可有效抑制胰腺癌细胞中SMO基因的表达,为进一步的研究提供了良好的实验工具.     

基质金属蛋白酶抑制因子-1 小干扰RNA载体构建及对肝星状细胞沉默效应的研究

目的构建TIMP-1小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并观察其对肝星状细胞株TIMP-1 mRNA表达的作用。方法根据siRNA设计原则,在TIMP-1 mRNA序列中选择2个特异性靶序列(447～465 nt、552～540 nt)及1条无关对照序列,体外合成对应发卡样DNA片段,将其克隆入pGEM-T连接载体,BamH I和Xho I分别双酶切pGEM-T及表达载体pRNAT-U6.2,胶回收粘末端将特异序列定向亚克隆构建TIMP-1 pRNAT-U6.2/siRNA载体,用脂质体包裹转染入T6细胞,采用RT-PCR检测TIMP-1 mRNA表达水平的变化。结果所构建的TIMP-1 pRNAT- U6.2/siRNA载体,经酶切鉴定与测序,结果显示特定位点靶序列与设计序列完全一致;转染T6细胞后,TIMP-1 mRNA表达明显降低。结论成功构建TIMP-1 siRNA载体TIMP-1 pRNAT U6.2/siRNA,转染T6细胞可以有效抑制TIMP-1 mRNA的表达。     

PAI siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建和鉴定针对PAI 的发卡样小干扰RNA（siRNA）真核表达载体PAI siRNA.方法 人工合成一对互补并编码相应短发夹状PAI siRNA 的寡核苷酸链, 将其插入到pSilencerTM 2.1-U6 neo 载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中, 采用逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 、West ern印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA 和蛋白的表达.结果 经测序证明PAI siRNA 序列正确;转染PAI siRNA 载体后,HpG2细胞PAI mRNA 和蛋白表达均较对照组明显下降（P ＜0.01）.结论 测序结果表明发卡样PAI siRNA 真核表达载体构建成功,转染Hp G2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达, 为进一步研究PAI siRNA 载体提供了实验基础.     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

下调PAI对HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物的影响

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)的发卡样小干扰RNA(siRNA)真核表达载体对人肝癌HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶PA(uPA)表达的影响。方法设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中构建重组载体后,采用脂质体转染方法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白对tPA和uPA表达的影响。结果转染后细胞中PAI含量降低,tPA和uPA的表达减少(均P<0.01)。结论测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中tPA和uPA的表达。     

RNAi对结肠癌SW480细胞Nucleostemin基因表达的影响

目的:探求RNA技术干扰人结肠癌SW480细胞Nucleostemin(NS)基因后,结肠癌SW480细胞NucleosteminmRNA和蛋白水平的表达,及细胞增殖情况变化.方法:构建Nucleostemin特异性真核表达载体,和脂质体共同转染SW480细胞后,采用Real-timePCR和Westernblot方法检测NS基因mRNA和蛋白变化,MTT法检测细胞的增殖情况.结果:与对照组相比较,RNAi干扰细胞后NSmRNA表达明显下降;NS蛋白表达亦明显下降(1.069±0.368,1.003±0.313,1.901±0.817,P<0.05;1.069±0.368,1.003±0.313,2.035±0.665,P<0.05),空白对照组(仅加入脂质体)和阴性对照组(RNAi错义序列)间无显著差异(2.035±0.665,1.9001±0.817,P>0.05).MTT显示RNA干扰后细胞增殖明显受到抑制.结论:通过特异性RNA干扰NS基因后,结肠癌SW480细胞增殖受到抑制.     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.