逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的：为了阐明中国结核病耐利福平菌株rpoB基因突变特点。方法：对212株结核分支杆菌菌株包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中利福平耐药株163株;利福平敏感株46株,及人工诱导的利福平耐药株3株。结果：有89．0％（145／163）的耐药株存在rpoB基因突变,而对照敏感株无突变。531位氨基酸突变率为49．1％;526位氨基酸突变率为17．8％;联合突变发生率为12．3％;还有2株细菌存在同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论：中国结核菌耐利福平菌株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸,二者总体突变率是66．9％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组,插入和缺失突变在我国比较罕见;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

序列分析重庆地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的　研究重庆地区结核分支杆菌对利福平 (R)的耐受与rpoB基因突变的关系。方法　PCR扩增 6 7株分离自重庆地区肺结核患者的耐R结核分支杆菌的rpoB基因片段 (319bp) ;测定扩增片段的序列 ,并与野型株序列作对比分析。 结果　 6 7株临床分离的耐R株中 ,8株 (12 % )无变异 ,5 9株 (88% )有突变 ,突变涉及 8个氨基酸位点。突变有 14种类型 ,4 9株(83% )的突变为单个密码子取代 ,9株为双密码子取代 ,1株为 3个碱基 (一个密码子 )插入 ,未检出碱基缺失。突变高发位点为 5 31位 (37/ 5 9)密码子 ,其次为 5 16位 (13/ 5 9)和 5 2 6位 (7/ 5 9)。 3株菌在 4 77位的谷氨酸 (Glu) ,天冬氨酸 (Asp)突变为首次发现。结论　重庆地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的突变密切相关 ,突变的类型与国外的报告基本相似。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法     

结核分支杆菌耐利福平与rpoB基因

90年代初 ,全球结核病呈现死灰复燃趋势。到目前为止 ,结核病仍是造成成人死亡的感染性疾病中最常见的病因 ,全球 2 6 %的可避免死亡与结核病有关。我国约有 6 0 0万结核病患者 ,每年死于结核病者约 2 5万 ,为死于其他各类传染病人数总和的 2倍 ,每年由结核病带来的直接损失超过 35亿。结核病疫情恶化的原因主要有两方面 :一是耐药 ,尤其是耐多药结核 (ＭＤＲ ＴＢ)的出现 ;另一原因是人类免疫缺陷病毒 (ＨＩＶ)感染的爆发流行。我国结核病具有耐药率高的特点 ,初治病人中耐药结核病占 2 8 1% ,复治病人中占 41 1%。耐药结核病中继发耐药占…     

应用线性探针分析快速检测耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的：检测上海地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变,评估线性探针分析（LiPA)法快速检测突变位点的意义。方法：对58株结核分支杆菌rpoB基因片段进行PCR扩增及DNA测序,从中选取18株耐药株和10株敏感株并应用LiPA法检测其突变位点,结果：LiPA法准确地检测出18株耐药株中17株的rpoB基因突变,10株敏感株均无突变;LiPA法检测耐药菌的敏感性为94．4％,与药敏结果的符合率为96．4％,结论：LiPA法可用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因的快速检测,而且具有较高的敏感性。     

聚合酶链反应－单链构象多态性用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系。方法以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析了４０株结核分支杆菌临床分离株。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法由ＰＣＲ扩增和扩增产物ＤＮＡ单链多态性分析组成。结果两对引物ＰＣＲ扩增产物分别为４１１和２５８ｂｐ，其敏感性分别为５ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ和１ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ；均为属特异性。４０株结核分支杆菌临床分离株２５８ｂｐ扩增片段ＳＳＣＰ图谱的特点：以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，１０株敏感株均无区别；单耐ＲＦＰ或包括ＲＦＰ多种抗结核药３０株，除３株外，其余２７株ＳＳＣＰ图谱有明显的区别；检测阳性率为９０％，特异性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可检测出耐ＲＦＰ结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变；该基因是ＲＦＰ的药物靶编码基因，它的突变与ＲＦＰ耐药性有密切关系，这有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究     

用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性

目的：研制一种新型DNA芯片,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测,方法：根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段,与芯片杂交,同时以DNA测序法为对照,结果：17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来,效率可达83％,患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测,无须进行培养。结论：用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度,该法快速,精确,可以应用于临床耐药性检测。     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析。结果PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%。结论PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。     

变性高效液相色谱法检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步探索

目的 探讨变性高效液相色谱(DHPLC)技术在MTB的利福平耐药菌株rpoB基因突变检测中的应用价值.方法 PCR扩增MTB的rpoB基因利福平耐药决定区,扩增产物与野生型DNA链形成异源双链,在65.4℃柱温下进行DHPLC分析.对DHPLC不同峰型菌株的rpoB基因片段进行测序,评价DHPLC技术的敏感度和特异度.结果 共分析46株MTB菌株,其中42株对利福平耐药,4株对利福平敏感.经DHPLC分析,产生15种不同图谱.测序结果表明,各图谱菌株突变特征不同.除D108和D24菌株的DHPLC峰形相同而突变特征不同外,其他菌株均为DHPLC峰型与基因多态性相一致,即DHPLC峰型相同则基因多态性相同,DHPLC峰型不同则基因多态性不同.结论 DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,敏感度和特异度高,可用于快速检测耐药MTB的基因突变.     

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG 和rpoB 的突变特征

目的 分析临床分离的结核分枝杆菌katG 和rpoB 基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法 采用比例法对六安地区65 株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katG 和rpoB 进行扩增、测序后进行分析。结果 60 株结核分枝杆菌中分别有有9 株耐异烟肼和14 株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9 株耐异烟肼菌株中,4 株katG 在315（Ａ GC→ACC 或ACA）位点发生突变,占44.4％;14 株耐利福平菌株中,11 株rpoB 分别在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC 或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6％;6 株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5 株katG 或rpoB 基因发生突变,占83.3％。结论 六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG 和rpoB 基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315（AGC→ACC 或ACA）位,而耐利福平在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。