肾缺血再灌注损伤后miR-210及其靶基因的变化

目的 观察缺血再灌注损伤(IRI)对小鼠肾脏mir-210及其靶基因Ephrin-A3表达的影响.方法 将10只成年昆明雌鼠随机分为缺血再灌注组(IR)、假手术组(Sham),每组5只.IR组完全阻断双肾蒂40 min后恢复血流,Sham组暴露左右双肾40 min后关闭腹腔.每组在手术4 h后取肾组织标本,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测mir-210表达水平;RT-PCR和酶标免疫组织化学染色法检测Ephrin-A3基因和蛋白的表达情况.结果 IR组miR-210表达水平明显上升(P<0.05).因miR-210对靶基因Ephrin-A3的负向调节作用,PCR结果显示IR组Ephrin-A3基因表达水平明显高于Sham组(P<0.01).Ephrin-A3蛋白主要表达在肾小管上皮细胞胞质中,Sham组Ephrin-A3蛋白表达水平较IR组明显升高(P<0.01).结论 肾缺血再灌注损伤明显影响miR-210及其靶基因Ephrin-A3的表达,miR-210表达的变化可能与肾缺血再灌注损伤的修复有关.     

microRNA-210基因修饰人脐静脉内皮细胞诱导血管形成

目的构建人microRNA-210(miR-210)慢病毒重组载体并转染人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells 12,HUVE-12),探讨其过表达对HUVE-12成血管的影响,为研究血管再生机制提供实验模型。方法构建pGCSIL-GFP-pre-miR-210重组质粒表达载体并转染HUVE-12,荧光显微镜观察GFP阳性表达细胞数及实时荧光定量PCR法检测miR-210表达变化;细胞分为空病毒对照组(LV-GFP对照组)和miR-210转染组(LV-miR-210-GFP组),流式细胞仪检测各组细胞ephrinA3表达变化;ELISA检测细胞培养上清中VEGF含量;将两组细胞分别接种于Matrigel观察血管形成能力。结果重组载体经酶切、测序鉴定正确,GFP表达强度在转染后48～72 h达峰值;实时荧光定量PCR检测结果显示:LV-miR-210-GFP组miR-210表达水平较LV-GFP对照组增加9.72倍(t=—11.10,P=0.00)。流式细胞仪检测结果显示LV-miR-210-GFP组ephrinA3阳性细胞率为12.52%±0.67%,明显较LV-GFP对照组(73.22%±1.45%)降低(t=—66.12,P=0.00);ELISA检测结果显示LV-miR-210-GFP组细胞上清中VEGF含量显著高于LV-GFP对照组([305.29±16.52)pg/mL vs.(42.52±3.11)pg/mL](t=—27.06,P=0.00);血管形成能力实验显示LV-miR-210-GFP组毛细血管管腔数为17.33±6.33,较LV-GFP对照组(6.33±2.33)显著增加(t=—2.83,P=0.04)。结论成功构建miR-210慢病毒重组载体,并能在HUVE-12中稳定表达,过表达miR-210能明显增强HUVE-12血管形成能力,为进一步研究miR-210调控血管新生的分子机制奠定了实验基础。     

外源性抗原诱导内皮细胞增殖及其MICA分子的表达

MHC-Ⅰ类相关链A(MICA)位于人类第6号染色体,属于非经典HLA-Ⅰ类基因家族.抗MICA抗体与肾移植排斥反应相关及影响移植肾长期存活的观点已得到学者的广泛认同~([1-2]).MICA分子在移植物血管内皮细胞表达,特别是在内皮细胞膜蛋白的表达.增加了MICA抗原在移植受者体内成为抗移植物靶目标的可能性~([3]).     

去骨瓣减压术对大鼠缺血缺氧性脑损伤后缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子表达的影响

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,它通过对下游靶基因的调控,使细胞对缺氧产生适应性反应[1].有研究结果显示,脑组织缺血缺氧可导致脑缺血半暗带HIF-1α的表达增加,并诱导血管内皮生长因子(VEGF)过量表达,刺激血管新生,改善局部血供,减轻缺血后的脑损伤[2]1.本研究旨在观察去骨瓣减压术对局灶性脑缺血大鼠梗死灶周HIF-1α、VEGF表达的影响,探讨该手术脑保护作用的可能机制.     

PET及MRI评价肿瘤乏氧及下游分子表达的进展

实体肿瘤生长导致局部组织缺氧微环境改变,缺氧诱导因子(HIFs)为其中最重要的调节因子。在乏氧情况下,受HIF-1α调控的下游靶基因主要有血管内皮细胞生长因子(VEGF)及葡萄糖转运体1(GLUT-1)基因等。近年来,随着多模态PET及MR成像在肿瘤诊断中的广泛应用,多项研究证实成像所得参数与肿瘤乏氧相关分子的表达存在相关性。本文对PET及多种功能MRI序列检测肿瘤内HIF-1α及其下游的靶基因VEGF及GLUT-1分子表达情况进行综述。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响以及靶基因预测

【】目的 明确miR-542-3p抑制骨肉瘤细胞系HOS以及SAOS2细胞侵袭能力,建立生物信息学miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics 转染HOS以及SAOS2细胞,进行Transwell小室细胞侵袭能力测定。利用基因表达共享数据库GEO联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。qPCR验证mir-542-3p转染HOS以及SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 mir-542-3p 转染组骨肉瘤细胞的侵袭能力较对照组明显降低(P<0.05)。数据库差异基因分析表明,miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共417个,其中185个基因表达下调。实时定量PCR结果显示,Targetsacn以及MiRanda数据库预测靶基因中,miR-542-3p转染细胞组的ILK, TBPL1和ETS1表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论 miR-542-3p通过下调ILK, TBPL1以及ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

PDTC对缺氧/再给氧时血管内皮细胞ICAM-1,VCAM-1表达的作用

目的为研究心肌缺血-再灌注损伤的机制和治疗途径,检测血管内皮细胞缺氧/再给氧后细胞间黏附分子-1(intracellular adhesion molecule 1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)的表达,探讨抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对血管内皮细胞表面细胞黏附分子表达的抑制作用.方法将培养的人胚肾血管内皮细胞分为3组,缺氧组:细胞经过缺氧/再给氧处理;PDTC组:在缺氧前于培养液中加入PDTC;对照组:未经处理.以多光子激光共聚焦显微镜分别检测3组细胞ICAM-1、VCAM-1的表达情况.结果对照组内皮细胞表面ICAM-1和VCAM-1呈较低表达,缺氧组呈较高表达;PDTC组ICAM-1和VCAM-1的表达明显低于缺氧组,但仍高于对照组.结论缺氧/再给氧促进内皮细胞活化,增强细胞黏附分子的表达,抗氧化剂PDTC能有效降低ICAM-1和VCAM-1的表达,为心肌缺血-再灌注损伤的治疗提供理论基础.     

低温缺氧条件下血管内皮细胞的基因表达及与单核细胞间的相互作用

目的探讨在低温缺氧条件下血管内皮细胞RNA转录变化以及血管内皮细胞和单核细胞间的相互作用在再灌注损伤早期过程中的意义。方法将人主动脉内皮细胞经过90min低温缺氧处理后培养4h和8h，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）评估相关基因的RNA转录变化；通过细胞粘附实验来检查纯化的单核细胞、CD4^＋ T淋巴细胞与内皮细胞早期粘附水平；通过流式细胞术检测单核细胞吞噬内皮细胞膜的情况。结果经低温缺氧处理的血管内皮细胞上调一系列的炎性细胞介素、共刺激分子以及内皮细胞素和内皮细胞素转换酶-1（ECE-I）、粘附因子等RNA转录水平，而对CD54的表达上调有限。CD4^＋T淋巴细胞与正常内皮细胞和经低温缺氧处理的内皮细胞呈低水平的早期粘附，而单核细胞则表现出与血管内皮细胞呈高水平的早期粘附，且对低温缺氧处理的内皮细胞的早期粘附水平明显增加。单核细胞在和血管内皮细胞的早期相互作用过程中可吞噬内皮细胞膜，但对经低温缺氧处理的内皮细胞膜的吞噬作用并没有增加；CD4^＋T淋巴细胞不具备乔噬内皮细胞膜的功能。结论血管内皮细胞经低温缺氧处理后上调多种炎性介素、共刺激分子、粘附因子等相关的RNA转录；单核细胞与血管内皮细胞间的相互作用在缺血再灌注损伤早期起始过程中扮演着重要的角色。     

人arresten基因的克隆表达及其对内皮细胞增殖的影响

目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因，并探讨其生物学活性。方法利用基因重组技术，从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段，亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中，构建表达载体pRSETAN。将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达。菌体经超声波破碎，镍柱亲和层析纯化并复性。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性。结果酶切鉴定和测序验证，表达载体构建正确。在表达宿主菌中，arresten基因获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白质的27％；表达产物经亲和层析纯化后，蛋白质纯度达96％。经复性，重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用。结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达；复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖。     

转染人补体调节基因对猪血管内皮细胞的保护作用

供者血管内皮细胞(EC)是猪到人异种移植时引发超急性排斥反应的靶抗原的主要分布部位。利用转基因技术让猪的内皮细胞表达人补体调节基因(hDAF)，可能会增强其血管内皮细胞的防御能力，借以克服超急性排斥反应的发生，联合转染一种以上人补体调节蛋白基因可能效果更好。为此，我们进行了如下实验。     

细胞膜微粒对内皮细胞凋亡影响的研究

目的探讨体外内皮细胞膜微粒（endothelial microparticle,EMPs）对血管内皮细胞凋亡功能的影响。方法将内皮细胞自身产生的膜微粒与内皮细胞共培养,评估共培养下内皮细胞凋亡的变化。结果 7.66×10~4,7.66×10~3,7.66×10~2个/ml浓度的EMPs组（简称高、中、低浓度组）其内皮细胞caspase-3活性、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）活性表达均高于0个/ml浓度EMPs的对照组（P〈0.05）。PCR检测凋亡基因变化后,发现高、中浓度EMPs组APAF-1（apoptotic protease activating factor-1）基因表达较对照增高（P=0.003、P=0.000）,低浓度组没有明显差异（P=0.272）,AIF（apoptosis-inducing factor）基因方面,以Realtime-PCR方法测定,RQ值代表的是各组/对照组的基因表达量,则提示高中浓度EMPs组AIF表达较对照增高（RQ=1.836、RQ=1.324）,低浓度组则呈现下降（RQ=0.569）。结论内皮细胞膜微粒在体外可促进血管内皮细胞凋亡发生。7.66×10~4、7.66×10~3、7.66×10~2个/ml浓度EMPs可促进细胞Caspase-3、PS表达活性增强,7.66×10~4、7.66×10~3个/ml浓度EMPs可促进APAF-1、AIF凋亡基因表达,7.66×10~2个/ml浓度无明显促进作用。     

缺氧诱导因子与肾移植

缺氧诱导因子是一种由氧依赖性α亚单位和组成性表达的β亚单位组成的异二聚体转录因子，通过转录上调它的靶基因的表达在细胞适应缺氧的过程中起核心作用，其中涉及到血管产生、红细胞生成、糖酵解等。近年来，HIF在移植肾缺氧缺血性损伤中的作用也逐渐受到人们的关注。本文就HIF的生物学特点、对靶基因的调节及移植肾缺氧缺血性损伤的作用、PHDs抑制剂的研究进展作一综述。     

MSCs在缺氧状态下的基因差异性表达

目的 探讨MSCs在缺氧环境中细胞生物学特性及相关生长因子的变化,为修复组织损伤提供临床应用依据。方法 体外进行MSCs缺氧处理,免疫荧光染色观察细胞特性,RT-PCR检测VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α基因,从细胞分化、生长因子和细胞信号通路等方面,来探讨MSCs在缺氧环境下发生的转变。结果 MSCs经1%O2缺氧培养24 h后,镜下观察示细胞成活良好,未见形态、生长方式等发生明显变化。免疫荧光及双荧光染色观察缺氧处理24 h的MSCs有向内皮细胞,特别是血管内皮转化的趋势。VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α在缺氧处理后的MSCs中表达均增强,而未经缺氧处理的MSCs相关因子表达微弱。结论 在缺氧的环境下,MSCs可向血管内皮细胞方向分化,并且与促进血管形成和生长相关的VEGF、b FGF、TGF-β和IL-1α基因表达均增强,可直接或间接促进损伤组织的血管化。     

缺氧诱导因子与肾移植

缺氧诱导因子是一种由氧依赖性α亚单位和组成性表达的β亚单位组成的异二聚体转录因子，通过转录上调它的靶基因的表达在细胞适应缺氧的过程中起核心作用，其中涉及到血管产生、红细胞生成、糖酵解等。近年来，HIF在移植肾缺氧缺血性损伤中的作用也逐渐受到人们的关注。本文就HIF的生物学特点、对靶基因的调节及移植肾缺氧缺血性损伤的作用、PHDs抑制剂的研究进展作一综述。     

缺氧诱导因子-1与缺氧诱导因子-2同肿瘤关系的比较

缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor）是广泛存在于人和哺乳动物体内的一种转录因子。可以上调多达150种靶基因的表达，如促红细胞生成素（EPO）、血管内皮生长因子（VEGF）、糖酵解酶等，是细胞在缺氧应答反应中最重要的调节因子。目前发现的缺氧诱导因子成员有HIF-1、HIF-2、HIF-3 3种，HIF-1在1992年由Semenza和Wang首次报道，对其功能研究也就相应地开展，     

缺氧诱导因子与肾细胞癌

肾细胞癌的缺氧适应与缺氧诱导因子(HIF)有关.HIF是由两个亚单位组成的二聚体,通过作用于靶基因的缺氧反应元件(HRE)调控相关基因的表达,在肾细胞癌血管生成方面起重要作用,进而影响肾细胞癌的增殖和转移.研究HIF与肾细胞癌的关系可为其治疗提供新的思路.     

碱性成纤维细胞生长因子作用血管内皮细胞后c-myc基因mRNA表达的实验研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)促进血管内皮细胞增殖的内在分子生物学机理.方法应用组织细胞培养及分子生物学Northern blot技术,检测经bFGF作用的血管内皮细胞中c-myc基因mRNA的表达情况.结果 bFGF作用血管内皮细胞后c-myc基因mRNA的表达增加(P＜0.05),可在2 h达到高峰,并与bFGF的剂量和作用时间有关.结论 bFGF促进血管内皮细胞增殖、分裂的作用与早期反应基因c-myc的激活与表达密切相关,c-myc基因的参与可能是血管内皮细胞由静止期进入增殖期的启动因素之一.     

缺氧对钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响及其与p38 MAPK信号通路活化的关系

目的 探讨缺氧对钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)表达的影响及其与p38MAPK信号通路活化的关系.方法 采用定量PCR方法Western blot技术,检测内皮细胞株的CASK在常氧和缺氧1、3、6、12 h条件下表达情况.采用Western blot技术,检测常氧和缺氧1、3、612 h条件下p38 MAPK 180位苏氨酸/182位酪氨酸双位点磷酸化情况,及p38信号通路特异性阻断剂SB203580预处理1 h,血管内皮细胞缺氧3 h后CASK蛋白的表达.采用双荧光素酶报告系统,分析常氧和缺氧1、3、6、12 h条件下CASK启动子报告基因的活性.结果 缺氧能够明显上调CASK mRNA和蛋白的表达,缺氧3 h,CASK mRNA的表达为常氧对照组的1.8倍,CASK蛋白表达为常氧对照组的1.4倍.p38 MAPK信号通路阻断剂SB203580预处理,能够以剂量依赖性方式抑制3 h缺氧诱导的内皮细胞CASK蛋白表达.不同时间的缺氧能够明显增强CASK荧光素酶报告基因的活性.结论 缺氧能够诱导内皮细胞CASK的表达部分依赖于p38 MAPK信号的活化.     

缺氧诱导因子与肾细胞癌

肾细胞癌的缺氧适应与缺氧诱导因子(HIF)有关。HIF是由两个亚单位组成的二聚体，通过作用于靶基因的缺氧反应元件(HRE)调控相关基因的表达，在肾细胞癌血管生成方面起重要作用，进而影响肾细胞癌的增殖和转移。研究HIF与肾细胞癌的关系可为其治疗提供新的思路。     

膜反应性溶解抑制物在细胞及小鼠体内的表达

目的 观察外源基因在猪血管内皮细胞及小鼠体内表达情况.方法 体外培养猪血管内皮细胞,脂质体转染法将pcDNA3-ICAM-2-Enhancer CD59cDNA转染猪的血管内皮细胞,以未转染的猪血管内皮细胞为阴性对照,人血细胞为阳性对照,经G418筛选(浓度为100 mg/L)获得具有抗性的克隆,通过流式细胞仪检测转染细胞的表达情况.通过显微注射将CD59基因片段导入小鼠授精卵,对出生的小鼠进行基因检测.结果 pcDNA3-ICAM-2-Enhancer-CD59cDNA重组质粒在细胞中表达强度为63.1%;转CD59基因小鼠外周血单核细胞(PBMCs)表达强度为73.38%.结论 以人细胞间黏附因子Ⅱ(ICAM-2)为启动子并带增强子的CD59重组基因在猪的血管内皮细胞及小鼠体内均高效特异表达.