增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素基因抗乳腺癌的实验

 目的通过建立裸鼠乳腺癌肿瘤模型,在体内实验中进一步证实携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒Ad-hE的抗肿瘤作用。方法在BALB/c裸鼠皮下种植人乳腺癌细胞MCF-7,建立移植瘤模型。在瘤体内注射Ad-hE治疗,观察肿瘤生长,免疫组化检测肿瘤细胞内皮抑素的表达和计数肿瘤间质中微血管的数量。结果Ad-hE具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用,瘤体内注射重组腺病毒后4周,Ad-hE治疗组肿瘤体积为(225.3±90.2)mm3,明显小于Ad-LacZ病毒对照组(794.9±189.8)mm3和空白对照组(890.7±102.5)mm3。免疫组化显示,乳腺癌细胞在感染腺病毒后能够有效表达内皮抑素,阳性细胞比率超过60%以上。Ad-hE治疗组瘤组织中血管数量(16.3±7.3)明显少于空白对照组(54.6±17.6)和Ad-LacZ病毒对照组(49.8±21.2)。结论增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素的表达,具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。     

重组腺病毒人内皮抑素的质量标准研究

目的: 建立重组腺病毒人内皮抑素的质量标准和检测方法. 方法: PCR法鉴定腺病毒载体的E2B区和插入基因,琼脂糖凝胶电泳检查重组病毒DNA酶切图谱.分光光度法测定病毒颗粒数,TCID50法测定病毒感染滴度.感染人肝癌细胞HepG2测定插入基因的表达量,感染人血管内皮细胞HM2测定表达产物的生物学活性.病毒的纯度分析采用A260/A280比值和HPLC法进行.采用A549细胞进行复制型腺病毒的检测.结果: 腺病毒载体E2B区和插入基因PCR扩增结果与理论相符,重组病毒DNA的酶切图谱与标准品一致.原液病毒颗粒数为2.4×1012 VP/ml,滴度为1.53×1011 IU/ml,比滴度为6.4% IU/VP;成品病毒颗粒数为1.0×1012 VP/ml,滴度为3.75×1010 IU/ml,比滴度为病3.8% IU/VP.以50 MOI重组腺病毒感染HepG2细胞48 h后培养上清人内皮抑素表达量为332 ng/ml.50 MOI重组腺病毒对血管内皮细胞生长的抑制率为55%.A260/A280为1.29,HPLC纯度为99.7%.复制型腺病毒为≤1RCA/3×1010 VP.其他各项检测指标均符合规定.结论: 建立了重组腺病毒人内皮抑素的质量标准及其检测方法,并用于该产品的质量控制.     

携带内皮抑素基因腺病毒对卵巢癌HO-8910细胞作用研究

[目的]探讨携带内皮抑素基因腺病毒对卵巢癌HO-8910细胞的抑制作用.[方法]采用细胞培养、光镜、电镜、MTT法、RT-PCR、Western blot、TUNEI,法分析检测结果.[结果]重组腺病毒pLP-Ad-ES能够引起HO-8910细胞凋亡细胞形态结构改变:pLP-Ad-ES能够抑制卵巢癌细胞HO-8910的增殖(P<0.01),并且能够促进细胞凋亡,存在时间一剂量依赖关系;在基因蛋白水平上,随着滴度的增加,内皮抑素的表达增加.[结论]pLP-Ad-ES对卵巢癌HO-8910细胞有明显的抑制作用,能够诱导细胞凋亡.     

腺病毒介导的内皮抑素基因治疗小鼠肺癌

目的 探讨内皮抑素对小鼠肺癌生长和转移的抑制作用及其对肿瘤内部新生血管的影响.方法 在C57BL/6小鼠背部皮下注射2×106 lewis肺癌(LLC)细胞,建立小鼠肺癌种植瘤模型,2周后,瘤内注射2×109 pfu内皮抑素腺病毒载体,观察内皮抑素对肿瘤生长、转移及生存率的影响,检测内皮抑素在肿瘤组织的原位表达和血液循环中的表达水平及持续时间.用免疫组化方法,检测肿瘤内部血管密度,观察治疗对肿瘤血管的影响.用透射电镜观察肿瘤细胞的凋亡情况.结果 免疫组化检测结果显示,内皮抑素蛋白在内皮抑素组的肿瘤组织中呈强阳性表达,而在空载体对照组和阴性对照组中呈阴性表达或很少量表达.用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测内皮抑素组血清内皮抑素浓度,第2周可达1540±560 ng/ml;1个月后,血清内皮抑素浓度降至对照水平.内皮抑素组的肿瘤体积和生存率,与空载体对照和阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).抗CD31抗体标记的肿瘤内血管密度(MVD)在内皮抑素组、空载体对照组和阴性对照组中,分别为37.5±4.6、65.2±5.8和68.5±4.5个/200倍视野,抗CD105抗体标记的肿瘤内MVD分别为10.5±3.2、39.7±5.6和42.4±4.8个/200倍视野,内皮抑素组与空载体对照组和阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).内皮抑素组的组织在电镜下呈凋亡相的肿瘤细胞多见.结论 腺病毒介导的内皮抑素基因可在体内高效、较长时间表达内皮抑素蛋白,对小鼠皮下种植瘤有一定的治疗作用,其作用的靶点是抑制新生血管的生成.     

腺病毒载体介导的内皮抑素基因的体外生物活性及其对小鼠黑色素瘤形成的影响

新生血管形成对肿瘤的生长具有重要意义.因此抑制血管生成成为肿瘤治疗研究的热点之一.     

腺病毒介导人血管抑素抑制乳腺癌生长的研究

目的：研究腺病毒介导的重组人血管抑制Plasminogen K5基因对乳腺癌的治疗作用。方法：通过PCR将人血纤维蛋白酶原的信号肽基因加至Plasminogen的K5结构域基因，克隆到质粒pCA13，并在293细胞中同源重组，得到腺病毒AdK5。将Ad-K5体外感染乳腺癌细胞B－Cap-37和血管内皮细胞ECV304，观察其对细胞生长的影响，同时在乳腺癌的裸鼠动物模型上，检测其对肿瘤生长的抑制作用。结果：在感染Ad-K5的B－Cap-37细胞中检测到K5基因mRNA的表达。Ad-K5对血管内皮细胞ECV304有抑制作用，但对癌细胞B-Cap-37没有直接抑制作用。动物实验表明Ad-K5能显著抑制肿瘤的生长。结论：K5基因能抑制乳腺癌实体瘤的生长。     

内皮抑素的研究新进展

肿瘤的抗血管生成疗法是通过肿瘤内新生血管的形成来抑制肿瘤的生长和转移。内皮抑素是当前该疗法中最具潜力的药物蛋白,本文综合介绍了该蛋白的结构和理化特征、生物学功能、体内分布和激活以及作用机制等方面的研究进展。     

重组人血管内皮抑素联合重组人p53腺病毒治疗乳腺癌的实验性研究

背景与目的目前多基因、多靶点联合治疗已成为肿瘤研究的方向之一,本文探讨重组人血管内皮抑素(endostatin,ES)联合重组人p53腺病毒(rAd/p53)对乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用.方法建立人乳腺癌裸鼠模型,成瘤后随机分为对照组、ES组、rAd/p53组和联合组,分别给予处理;观察裸鼠的一般情况、体重和肿瘤的体积,并检测肿瘤组织微血管密度(MVD,microvessel density)和血管内皮生长因子(VEGF,vascular endothelial growth factor)的表达.结果成瘤后ES组,rAd/p53组和联合组抑瘤率分别为1.75%、43.36%和58.68%,rAd/p53组和联合组可明显抑制肿瘤生长(P＜0.05),联合组抑瘤作用更为显著;对照组、ES组、rAd/p53组与联合组肿瘤组织的MVD及VEGF表达H-评分分别为(30±5、24±4、24±4、18±4)和(46±8、39±8、40±5、29±5),联合组均低于其余各组,差异有显著性(P＜0.05);各组均未见不良反应,体重变化无显著性(P＞0.05).结论重组人血管内皮抑素联合rAd/p53可显著抑制裸鼠乳腺癌的生长及微血管生成.     

重组人血管内皮抑素联合重组人P53腺病毒对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制

摘 要 目的: 探讨重组人血管内皮抑素（recombinant human endostatin,ES）联合重组人P53腺病毒（rAd/P53）对乳腺癌细胞MCF7裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：建立裸鼠荷人乳腺癌模型，随机分为对照组、ES组、rAd/P53组和两药联合组,分别给予相应治疗；观察肿瘤生长，免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度（microvessel density，MVD）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达。结果：各治疗组均可明显抑制移植瘤生长， ES组、rAd/P53组和联合用药组的抑瘤率分别为51.67％、48.74％和75.54％，联合用药组抑瘤作用最为显著（P<0.05）。对照组、ES组、rAd/P53组与联合用药组的移植瘤组织MVD分别为31.17±2.48、20.33±4.84、22.33±3.88及12.50±2.74，VEGF 表达H评分分别为45.33±589、35.83±546、33.67±4.80及22.33±4.41，联合用药组的MVD和VEGF表达显著低于其余各组（P<0.01）。 结论：重组人ES联合rAd/P53治疗可显著抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生长及微血管生成。     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

携带内皮抑素基因的腺病毒对HO-8910细胞裸鼠移植瘤的影响

[目的]探讨携带内皮抑素基因的腺病毒(pLP-Ad-ES)对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其作用机制。[方法]采用细胞培养、移植瘤模型建立、RT-PCR、免疫组化等方法观察pLP-Ad-ES、pLP-Ad-ES+顺铂(DDP)对裸鼠移植瘤的影响及VEGF、MMP-2、Endostatin的表达。[结果]pLP-Ad-ES、pLP-Ad-ES+DDP能够抑制裸鼠移植瘤的生长,有明显的抑瘤作用(P<0.05);经腺病毒作用后,裸鼠移植瘤中MMP-2、VEGF呈现低表达、Endostatin呈现高表达。[结论]pLP-Ad-ES能够抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生长;同时能够抑制VEGF、MMP-2的表达,增强Endostatin的表达,提示内皮抑素的作用机制可能与抑制血管生成和调节基质金属蛋白酶有关。     

负载人microRNA-149的复制缺陷型腺病毒对人肝癌细胞株增殖的影响

目的 包装负载人microRNA-149的复制缺陷型腺病毒(Ad-miR149),并检测其对人肝癌细胞株增殖的影响.方法 全基因合成microRNA-149前体核苷酸序列,插入腺病毒穿梭质粒的多克隆位点,随后与包装质粒共转染人胚肾293细胞,包装负载microRNA-149的复制缺陷型腺病毒;采用MMT方法检测Ad-miR149对人肝癌细胞株增殖的影响.结果 成功包装负载人microRNA-149的复制缺陷型腺病毒,采用倍比稀释法检测病毒滴度为5× 109 pfu/ml.采用电子显微镜技术,观察到HEK293细胞中大量包装病毒颗粒.采用PCR扩增,Ad-miR149可获得腺病毒及microRNA-149特异片段,而对照Ad-LacZ只能扩增出腺病毒特异片段;采用MTT方法发现,Ad-miR149可显著抑制肝癌细胞株增殖.结论 成功包装负载人microRNA-149的复制缺陷型腺病毒并初步证实其对肝癌细胞增殖的抑制作用.     

携带凋亡素基因重组腺病毒的制备及诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究

摘 要：［目的］ 利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其体外诱导结肠癌细胞凋亡的作用。［方法］ 设计VP3 cDNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序列,与线性pShuttle-IRES-hrGFP连接构建pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒,PCR和EcoR Ⅴ酶切电泳鉴定;重组穿梭质粒经Pmel酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,PCR、PacI酶切电泳及测序鉴定;线性化重组腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞进行pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其作用人结肠癌SW480细胞,观察其对细胞凋亡及周期分布的影响。［结果］ pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建成功;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出402bp的片段,测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中,且其序列与GeneBank中VP3序列完全一致;成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu/ml,重组腺病毒可阻滞结肠癌细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,MOI值越大作用效应越显著(P<0.05,P<0.01)。［结论］ 细菌内同源重组法可快速、高效制备携带凋亡素基因的重组腺病毒,并具有较强的抗肿瘤作用,为深入研究VP3基因功能提供了选择。     

柯萨奇病毒-腺病毒受体在结肠癌组织中的表达及意义

目的：柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor，CAR）介导腺病毒与靶细胞之间的粘附，是腺病毒转染靶细胞的限速因子。本文分析CAR在瘤旁上皮组织、结肠肿瘤原发灶和淋巴结转移灶中的表达．为设计腺病毒载体基因治疗方案提供依据。方法：采用免疫组织化学方法检测62例结肠癌组织中CAR的表达．分析CAR表达与临床病理特征的关系。结果：与瘤旁上皮组织相比，肿瘤组织普遍存在CAR表达下调．但CAR在原发灶和淋巴结转移灶的表达水平无明显差异。CAR的表达水平与患者年龄及肿瘤大小相关。结论：结肠癌组织中存在CAR表达下调，提示在设计腺病毒载体基因治疗方案时应充分考虑CAR表达变化对疗效的影响.     

人肝细胞癌中AFP基因的表达

目的：探讨ＡＦＰｍＲＮＡ在人肝细胞癌中的表现规律。方法：用ＲＴ－ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ技术检测３０例肝癌组织及癌旁组织ＡＦＰｍＲＮＡ；放免法检测其血清ＡＦＰ。结果：２８例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性（２８／３０），２例癌旁组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性；９例血清ＡＦＰ阴性者有７例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性；２例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ及血清ＡＦＰ均阴性。结论：人肝细胞癌ＡＦＰ基因表达调控形式不同，ＡＦＰｍＲＮＡ在早期诊断肝细胞癌中有一定价值。     

V型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建腺病毒纤维蛋白基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达,为腺病毒靶向性载体构建创造条件。方法：采用限制性内切酶技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆,最后完成克隆纤维蛋白基因并构建其真核表达质粒,用脂质体法将构建好的真核表达质粒瞬时转染COS-7细胞,于转染后72h,用Western blot法检测所表达的蛋白。结果：克隆成功纤维蛋白基因,并构建纤维蛋白基因真核表达质粒pcDNA/Fiber,经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性,Western blot结果显示,新表达蛋白在变性条件下大小为62kD,而在非变性条件下为186kD。结论：纤维蛋白基因真核表达质粒能在真核细胞中表达,产物具有三聚体结构。可用于腺病毒靶向性载体的构建。     

重组人内皮细胞生成抑制因子-Endostation的表达和纯化

目的:利用Pichia pastoris菌株高效表达重组人内皮细胞生长抑制因子(rh-Endostatin),并将其纯化至均质。方法:将构建的菌种Pichia pastoris X33/pLW202扩增后接种至发酵培养基中,诱导表达后收获上清,将上清浓缩后经亲合层析、凝胶层析后得到高纯度rh-Endostatin。结果:从发酵上清中可得到60mg/L高纯度的rh-Endostatin,经HPLC检测纯度达98％以上。结论:在Pichia pastoris表达系统中,实现了rh-Endostatin的高效分泌性表达。     

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

 目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。