TRAIL蛋白联合顺铂抑制裸鼠横纹肌肉瘤生长的实验研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白及联合顺铂对RD人横纹肌肉瘤裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的作用机制.方法 将RD人横纹肌肉瘤细胞制成细胞悬液后接种于裸鼠皮下,成瘤后将裸鼠随机分4组:生理盐水组、TRAIL组、顺铂组及两药联合组.检测裸鼠的重量和体积;测定裸鼠肝功能、尿素氮及肌酐;另取肝肾组织进行切片,HE染色观察;用FCM方法检测肿瘤组织Fas表达;用RT-PCR检测DR4和DR5mRNA的表达.结果 各组裸鼠实验前后的体重变化无明显差异;DDP组和TRAIL+DDP组裸鼠的血清丙氨酸转氨酶高于生理盐水组,DDP组与TRAIL+DDP组裸鼠尿素氮和肌酐值比较,无明显差异;TRAIL组、DDP组和TRAIL+DDP组移植瘤的重量均明显降低;各组肝肾组织切片观察未见明显改变;TRAIL+DDP组Fas表达水平高于DDP组和TRAIL组;DDP组和TRAIL+DDP组裸鼠移植瘤细胞的DR5mRNA、DR4mRNA表达水平明显升高,而TRAIL组没有明显改变.结论 TRAIL和顺铂对裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,联用有协同作用.     

Caspase-8和DR5在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)能诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无诱导凋亡作用。大多数神经母细胞瘤细胞株对TRAIL的诱导凋亡作用耐受与其Caspase8表达缺失有关,也与细胞表面TRAIL受体的表达和分布有关。该文主要探讨Caspase8及TRAIL受体DR5的表达在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞株SKNDZ凋亡中的作用及其发生机制。方法：应用RTPCR方法检测IFNγ作用前后SKNDZ细胞Caspase8的表达;应用WesternBlot方法检测化疗药作用前后SKNDZ细胞DR5的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测TRAIL、IFNγ+TRAIL、化疗药+TRAIL及化疗药+IFNγ+TRAIL对SKNDZ细胞生长及凋亡的影响。结果：SKNDZ细胞不表达Caspase8,IFNγ作用后的SKNDZ细胞Caspase8表达明显增加。对照组未检测到DR5蛋白表达,而阿霉素和依托泊苷处理后检测到DR5蛋白表达。表达Caspase8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感,而同时表达Caspase8和DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感。阿霉素/依托泊苷+IFNγ+TRAIL组早期凋亡率为:(17.9±3.6)%、(14.8±3.3)%,与IFNγ+TRAIL组(3.9±1.2)%比较,差异有显著性(F=26.233,P<0.01)。结论：同时表达Caspase8和DR5的SKNDZ细胞恢复了对TRAIL的敏感性,Caspase8和DR5在TRAIL诱导SKNDZ细胞凋亡中起着十分关键的作用。     

IFNγ联合TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的探讨IENγ（γ干扰素）对TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）诱导神经母细胞瘤细胞株SMS-KCNR（KCNR）细胞凋亡的影响及其发生机制。方法应用RT-PCR方法检测IFNγ作用前后KCNR细胞Caspase8的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪（FCM）检测IFNγ、TRAIL、IFNγ＋TRAIL及IFNγ＋Caspase8抑制剂（zIETD-FMK）＋TRAIL对KCNR细胞生长及凋亡的影响；应用比色法测定Caspase8相对活性。结果KCNR细胞不表达Caspase8，IFNγ作用48h后的KCNR细胞Caspase8表达明显增加；KCNR细胞对TRAIL不敏感，IFNγ诱导表达Caspase8的KCNR细胞对TRAIL敏感；IFNγ＋TRAIL组Caspase8相对活性明显高于TRAIL组及抑制剂组；zIETD-FMK能阻断Caspase8的活化而抑制TRAIL对KCNR细胞的诱导凋亡作用。结论IFNγ通过诱导Caspase8表达而逆转KCNR细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受。     

沉默Pin1表达抑制高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡

目的　研究沉默Pin1表达对高氧诱导人肺泡上皮细胞(A549细胞)凋亡的影响。方法　在体外常规培养A549细胞, 随机分为对照组、高氧组、空载体组和Pin1-shRNA组, 以3 L/min速度向各处理组细胞中通入95% O2和5% CO2的高纯混合气10 min。培养24 h后, 倒置相差显微镜下观察细胞形态; 流式细胞术检测细胞凋亡率; SP细胞免疫化学法检测细胞凋亡相关蛋白XIAP和Caspase-9表达; 荧光显微镜检测细胞线粒体活性氧簇(ROS)及线粒体膜电位。结果　高氧组和空载体组细胞均生长状态差, Pin1-shRNA组活细胞数量较高氧组和空载体组多, 但比对照组少。与对照组相比, 高氧组和空载体组细胞凋亡率增加、Caspase-9表达增加、XIAP表达降低、ROS含量增加、线粒体膜电位下降(均P<0.05)。而Pin1-shRNA组与高氧组和空载体组相比, 细胞凋亡率下降、Caspase-9表达降低、XIAP表达增加、ROS含量降低、线粒体膜电位升高(均P<0.05), 但与对照组相比差异亦有统计学意义(均P<0.05)。结论 抑制人肺泡上皮细胞Pin1表达可减轻高氧诱导的细胞凋亡。     

苦参碱联合顺铂对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞PDCD4表达的影响

目的探讨苦参碱及苦参碱联合顺铂对人肾母细胞瘤SK—NEP-1细胞存活及凋亡的影响,以及可能的作用机制。方法苦参碱、顺铂单独及联合作用SK-NEP-1细胞,实验分对照组、顺铂干预组、苦参碱干预组、苦参碱联合顺铂干预组。应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测SK-NEP-1细胞的存活率,用流式细胞仪检测其凋亡率,逆转录聚合酶链反应法检测其PDCD4mRNA的表达。结果各组SK—NEP-1细胞的存活率及凋亡率与对照组比较、相同浓度的苦参碱干预组与苦参碱联合顺铂干预组比较及苦参碱联合顺铂组与J顿铂干预组比较,SK-NEP-1细胞的存活率及凋亡率差异均有显著性（P〈0．05）。各实验组均能提高PDCD4mRNA的表达,与对照组比较,差异有显著性（P〈0．05）。苦参碱联合顺铂组与苦参碱干预组及顺铂干预组比较,SK—NEP-1细胞PDCD4mRNA表达均显著提高（P〈0．05）。结论苦参碱可浓度依赖性的抑制SK-NEP-1细胞的增殖并诱导其凋亡,从而提高对顺铂化疗的敏感性,该作用可能与提高细胞内PDCD4mRNA的表达有关。     

Caspase-8在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的：应用干扰素(IFNγ)诱导神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）细胞caspase 8的表达并观察其是否可以恢复NB细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的敏感性。方法：应用RT PCR方法检测IFNγ作用前后NB细胞caspase-8 mRNA的表达;应用Alamar Blue法及流式细胞术检测IFNγ、TRAIL、IFNγ+TRAIL、IFNγ+caspase-8抑制剂zIETD-FMK+TRAIL对NB细胞生长及凋亡的影响;应用比色法测定NB细胞caspase-8相对活性。结果：对TRAIL敏感的CHP212细胞表达caspase-8,且经IFNγ处理后caspase-8 表达水平逐步增加;对TRAIL不敏感的SY5Y细胞不表达caspase-8,IFNγ作用后其caspase-8 mRNA表达明显增加。IFNγ与TRAIL联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。CHP212细胞caspase-8相对活性随TRAIL作用时间的延长逐步升高;IFNγ与TRAIL联合作用的SY5Y细胞caspase-8相对活性明显高于未加药物处理的对照组、IFNγ组、TRAIL组及抑制剂组。结论：表达caspase-8的NB细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感,TRAIL诱导NB细胞凋亡过程中伴随caspase-8活性的增加。［中国当代儿科杂志,2010,12(11)：902-907］     

9-顺式维甲酸协同γ-干扰素诱导神经母细胞瘤分化、凋亡及生长抑制的实验研究

目的 观察9-顺式维甲酸（9-cis retinoic acid，9-cis RA）联合γ干扰素（gammm interferon，γ-IFN）在体外诱导神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）SK-N-SH细胞分化、凋亡过程中细胞形态、周期的变化，探讨其协同作用的效果及其机制。方法 将细胞分为A（对照组）、B（9-cisRA用药组）、C（γ-IFN用药组）和D（9-cisRA和γ-IFN联合用药组）4组，在处理后适当的时间分别观察细胞形态学变化，进行分化神经节细胞计数，用Hoechst-PI荧光染色法观察细胞的凋亡和死亡，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定NB细胞抑制率，流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测细胞周期分布及其凋亡和死亡。结果 联合用药组细胞形态学分化明显，神经节细胞分化率显著高于其他各组（P〈0．01）；MTT法测定显示联合用药能显著提高NB细胞抑制率并明显优于单独用药；Hoechst-PI荧光染色及FCM钙依赖性磷脂结合蛋白V和碘化丙啶（annexin V／PI）染色法检测一致显示联合用药对于诱导NB细胞早期凋亡和坏死具有显著的协同作用；FCM细胞周期动力学分析发现联合用药组C0-G1期细胞比率增加，S期细胞比率减少。结论 9-cisRA联合γ-IFN在体外对NB细胞的分化、凋亡和生长抑制能产生明显的协同作用，为其联合应用于临床提供理论依据和指导。     

MYCN基因表达抑制促TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的神经母细胞瘤(NB)为小儿常见恶性肿瘤。MYCN基因高扩增NB细胞对TRAIL诱导凋亡多有抵抗。我们以MYCN基因高扩增NB细胞株为研究对象,抑制其MYCN基因的表达,探讨其对TRAIL诱导凋亡有无增强作用。方法构建MYCN siRNA,转染NB细胞株SK-N-BE(2),抑制MYCN基因表达后,Western-blot法检测SK-N-BE(2)细胞Bcl-2、Bcl-xL、Bid、DR4、DR5表达的变化,ELISA法检测细胞凋亡。结果转染MYCN siRNA的SK-N-BE(2)细胞中MY-CN基因表达显著降低(P<0.05)。MYCN基因表达抑制后,SK-N-BE(2)细胞DR5、Bid表达增高(P<0.05),Bcl-2、Bcl-xL表达降低(P<0.05),DR4表达无变化(P>0.05),TRAIL诱导细胞凋亡显著增强(P<0.05)。结论 MYCN基因表达抑制后,可调控Bcl家族中相关蛋白、DR5的表达,促进TRAIL诱导NB细胞凋亡。     

苦参碱联合顺铂对SH-SY5Y细胞药物敏感性及TrkB表达的影响

目的探讨不同浓度苦参碱对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞存活及凋亡的影响,及苦参碱降低顺铂化疗耐药性的作用及可能机制。方法分别以全反式维甲酸(ATRA)、脑源性神经生长因子(BDNF)、顺铂、苦参碱处理SH-SY5Y细胞,实验分对照组、ATRA诱导的顺铂干预组、顺铂干预组、苦参碱干预组、苦参碱联合顺铂干预组。应用四甲基偶氮蓝比色法检测苦参碱与顺铂对SH-SY5Y细胞存活率的影响,流式细胞仪检测苦参碱与顺铂对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响,Western-blot方法检测SH-SY5Y细胞的p-TrkB表达。结果除ATRA诱导的顺铂干预组外,其余各组SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);顺铂干预组与ATRA诱导的顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);相同浓度的苦参碱干预组与苦参碱联合顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);苦参碱联合顺铂组与顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。苦参碱0.5 mg/ml组与顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。各组SH-SY5Y细胞间,p-TrkB的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论苦参碱可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖并诱导凋亡,从而提高顺铂化疗的敏感性,该作用与TrkB/BDNF信号通路(间)无相关性。     

铁对白血病细胞HL-60线粒体膜电位及凋亡的影响

目的研究铁对人白血病细胞HL-60线粒体膜电位(ΔΨm)及凋亡影响,探讨其可能机制。方法HL-60细胞分别与10、50、100μmol/L去铁胺(DFO)和10、100μmol/L三氯化铁(FeCl3)共培养,分别造成细胞内铁剥夺和富铁状态,噻唑蓝(MTT)法检测不同铁状态下细胞活力变化;相差显微镜观察凋亡细胞的形态学改变,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率及ΔΨm变化;原位杂交法检测凋亡基因Bax转录水平。结果DFO组细胞生长率呈下降趋势,而FeCl3组细胞生长率呈上升趋势;HL-60细胞经DFO处理后,细胞凋亡率增加、ΔΨm下降(P<0.01);100μmol/L DFO作用细胞244、8 h后,凋亡基因Bax的转录水平均较对照组增高(P<0.01)。FeCl3组细胞ΔΨm及Bax转录无明显变化,但凋亡率较对照组略下降。结论铁剥夺可降低ΔΨm,诱导HL-60细胞凋亡;而富铁对细胞ΔΨm无明显影响,但可增强细胞活力,使细胞凋亡率下降。