重组腺病毒rAdCDglyES治疗宫颈癌的体外实验研究

目的:构建含CDglyES融合基因的重组腺病毒,并观察其在体外对宫颈癌细胞的直接抑瘤作用和对血管内皮细胞的抑制作用。方法:用PCR方法扩增CD基因和glyES基因片段,构建成腺病毒穿梭质粒pAdCDglyES。用细菌内同源重组方法与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1重组构建出重组腺病毒质粒prAdCDglyES。经脂质体介导转染293细胞,进而扩增获取重组腺病毒rAdCDglyES。用MTT法检测rAdCDglyES/5-FC系统对宫颈癌细胞株HeLa细胞的生长抑制率及其表达产物对脐静脉血管内皮细胞ECV-304增殖的影响。结果:纯化的rAdCDglyES滴度为1×1013.3TCID50/L,对HeLa细胞的生长抑制率达(84.1±7.3)%,高于对照rAd-LacZ/5-FC系统的(23.1±14.1)%,差异有统计学意义(P<0.01)。浓缩的转染了rAdCDglyES的细胞培养上清液对ECV-304细胞增殖的抑制率为(77.7±1.8)%,高于同样浓缩的转染rAd-CD细胞培养上清液抑制率的(22.9±9.7)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:rAdCDglyES在体外对宫颈癌具有直接和间接抑瘤作用。     

组织型纤溶酶原激活物重组腺病毒载体的构建及其转染ECV304细胞后对血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的 评估外源性组织型纤溶酶原激活物(t-PA)对ECV304细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响.方法 应用细菌内同源重组技术快速构建Adt-PA腺病毒重组质粒,转染不同病毒滴度Adt-PA至ECV304细胞,转染比率(MOI)分别为1∶10、1∶50、1∶100,选取合适MOI值;病毒转染后检测ECV304细胞内t-PA蛋白的表达.然后将培养的ECV304细胞分为二组,在培养液中加入Adt-PA混合培养24 h和48 h分别作为实验组1和实验组2,加入空病毒Ad混合培养48 h作为对照组,比较各组细胞中VEGF mRNA的转录和蛋白表达水平.结果 成功构建了重组腺病毒Adt-PA.当MOI为1∶50时,细胞转染效率为(69.6±21.2)%,且对ECV304细胞增殖具有一定的促进作用;Adt-PA转染ECV304细胞后在72 h内随着时间的延长其蛋白表达量逐渐升高(P<0.01);细胞内VEGFmRNA的转录水平和蛋白表达量在实验组1和2中较对照组均有明显升高(P<0.01).结论 构建的t-PA腺病毒表达载体可有效感染ECV304细胞并可显著增加其VEGF的表达水平.     

LR重组法构建重组腺病毒rAd5-Vpr

目的:构建携带HIV-1Vpr基因的重组腺病毒。方法:采用限制性内切酶消化和T4DNA连接酶连接的方法,将Vpr基因克隆至腺病毒穿梭质粒pTrack-C上,然后通过重组穿梭质粒pTrack-C-Vpr和腺病毒骨架质粒pAdeno体外LR位点特异性重组的方法,将Vpr基因转移至腺病毒骨架质粒pAdeno上,最后重组骨架质粒pAdeno-Vpr鉴定正确后经PacI酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-Vpr。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测病毒滴度。结果:PCR鉴定重组腺病毒rAd5-Vpr构建成功;扩增后检测病毒滴度约为5×108PFU/mL。结论:应用LR重组法能成功构建携带HIV-1 Vpr基因的重组腺病毒,扩增后滴度能满足实验需要,为进一步相关研究的开展奠定了基础。     

携带内皮抑素复制缺陷型腺病毒载体的构建及其应用

目的构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,并将其转染胰腺癌细胞株,探讨其体外抑制血管形成的活性。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2 000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo,用氯化铯密度梯度超速离心法纯化,用50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3,并测定感染的胰腺癌细胞上清液mEndostatin的表达及观察其抑制血管形成的活性。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010pfu／ml,体外能高效转染胰腺癌细胞株,可分泌表达有抑制血管形成活性的mEndostatin。结论本实验所构建的mEndostatin重组腺病毒表达载体能有效表达具有生物活性的mEndostatin,为体内胰腺癌的基因治疗奠定了基础。     

重组pAd/CMV/V5-DEST-p16载体的构建及其对人肝癌细胞的抑制作用

目的构建pAd/CMV/V5-DEST-p16重组腺病毒载体,并观察野生型p16基因对人肝癌细胞SMMC7721株的抑制作用。方法合成人p16-INK4表达基因。构建pENTR 1A-p16质粒。通过LR反应,入口克隆pENTR 1A-p16质粒的外源性合成的修饰后的p16 cDNA,取代目的载体pAd/CMV/V5-DEST中的ccdB基因,形成表达克隆pAd/CMV/V5-DEST-p16。测序证实质粒含有目的基因。PacI酶切后的重组腺病毒载体,通过脂质体2000介导,转染293A细胞,产生缺陷性的重组腺病毒。W estern blot分析显示在由重组腺病毒介导的野生型p16基因在肝癌细胞SMMC7721中能够表达蛋白。被感染的细胞的生长受抑制。结果构建了重组p16腺病毒载体,产生缺陷性的重组腺病毒,野生型p16基因对人肝癌细胞SMMC7721株有抑制作用。结论用通路克隆系统构建重组p16腺病毒载体稳定、可靠、方便,腺病毒能够介导野生型p16基因在肝癌细胞中表达,并抑制细胞的生长。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

晚期糖化终产物受体、核因子-κB双基因反义RNA抑制糖化终产物刺激的炎症因子表达

目的:观察晚期糖化终产物受体(receptor ofadvanced glycation endproducts,RAGE)、核因子-κB(NF-κB)双基因反义RNA对晚期糖化终产物(ad-vanced glycation endproducts,AGEs)刺激ECV304细胞分泌炎症因子的影响。方法:酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法观察AGEs对ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6的影响,应用脂质体将RAGE、NF-κB单/双基因反义RNA转染ECV304,流式细胞仪、筛选低表达RAGE、NF-κB的细胞株,观察RAGE、NF-κB双基因反义RNA对AG-Es刺激ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6的影响。结果:AGEs可引起ECV304细胞分泌TNF-α和IL-6增加,诱导作用具有时间和剂量依赖规律。稳定转染筛选出低表达RAGE、NF-κB的细胞株,在AGEs100 mg.L-1诱导下双基因转染细胞ECV-asRAGE-asP65克隆中RAGE、NF-κBp65表达抑制率分别为(62.2±8.7)%及(37.2±7.1)%。AGEs 100 mg.L-1刺激下ECV-asRAGE-asP65克隆分泌TNF-αI、L-6较空载体转染细胞、单基因转染细胞减少更明显(P<0.01)。结论:RAGE、NF-κB双基因反义RNA可抑制AGEs刺激的ECV304细胞的TNF-α和IL-6释放。     

裂解型腺病毒Ad-E1A的构建以及体外对肝癌细胞的作用

目的 构建Ad-E1A裂解型腺病毒载体,研究其对肝癌细胞的裂解作用.方法 以QBI-293A细胞基因组DNA为模板,用特异性引物PCR法扩增E1A基因,酶切后连接到pAdTrack-CMV转移质粒上,用PmeI酶对pAdTrack-CMy-E1A线性化后,与pAdEasy-1共转化在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-E1A;再用PacI酶切对重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-E1A腺病毒子.在QBI-293A细胞中多轮感染后获得高效价的病毒.将Ad-EIA腺病毒感染SMMC-7721,并用MTT和流式细胞仪检测Ad-E1A对人肝癌细胞生长和细胞周期的影响.结果 获得高滴度的重组裂解型腺病毒Ad-E1A.Ad-E1A感染SMMC-7721后,出现明显的细胞病变.Ad-E1A对人肝癌细胞SMMC-7721的生长有明显抑制,48 h后效果明显.Ad-E1A可直接诱导SMMC-7721细胞的凋亡.结论 裂解型腺病毒Ad-E1A构建成功并可以显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并在肝癌细胞中复制造成细胞裂解,诱导肝癌细胞的凋亡.     

Minocycline对rhHGF刺激ECV304细胞株表达MMP9的抑制作用

目的　探讨重组人类肝细胞增殖因子(recombinant human hepatocyte growth factor, rhHGF)刺激ECV304细胞株表达基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase 9, MMP- 9)的作用及米诺环素(minocycline)的影响作用。方法　绘制正常ECV304细胞株生长曲线,明确最适生长浓度及对数生长期;明确rhHGF及minocycline的作用浓度;流式细胞仪(flowcytometer, FCM)检测ECV304细胞株的MMP 9水平。结果　①ECV304细胞株的最适生长浓度为1. 0E+4 /mL,对数生长期为3～5d;rhHGF的作用浓度为8ng/mL,minocycline的作用浓度为1. 0E-5mol/L。②对照组MMP 9的表达量为39.74%;培养基中加入rhH GF8ng/mL后,细胞存活率为1.388169±0.102033 (P<0. 01 ),MMP 9的表达量为40.32%;培养基中加入minocycline1. 0E-5mol/L后,细胞存活率为0.294526±0. 076829(P<0. 01),MMP-9的表达量为19.92%。③培养基中加入minocycline1. 0E-5mol/L15min后加入rhHGF8ng/mL,细胞存活率为0. 397291±0.099504(P<0. 01), MMP-9的表达量为22.28%。结论　rhHGF可刺激ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量增加;minocycline可抑制ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量降低;minocycline可拮抗rhHGF所引起的ECV304细胞株增殖,从而使MMP-9的表达量降低。     

Fas配体基因逆转录病毒途径转染骨髓CD_(34)~+细胞

目的　借助逆转录病毒途径 ,FasL基因转染骨髓CD34+3 4 细胞。方法　将人FasLcDNA顺向插入逆转录病毒载体质粒PLXSN ;PLXSN -hFasL质粒脂质体转染PA317包装细胞 ;G418筛选抗生克隆 ;PCR鉴定整合细胞 ;扩增 ;制毒 :病毒滴度测定。试剂盒分选骨髓CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪分析其纯度 ;体外扩增培养 (IL -3+IL -6 +SCF) ;病毒上清转染CD34+3 4 细胞 ;流式细胞仪检测FasL阳性细胞率。结果　成功构建PLXSN -hFasL质粒 ;PA317细胞进行包装后所获假性病毒上清滴度为 1.7× 10 5CFU/ml ;对 11份正常人或良性贫血患者髓血进行CD34+3 4 细胞分选 ,所得CD34+3 4 细胞数为 1.35± 0 .45× 10 5,纯度为 85 %～ 97% ;体外扩增培养 10～ 12d ,细胞数达到 2 .5± 0 .7× 10 6(扩增约 18.5倍 ) ;病毒上清转染后 48～ 72h ,流式细胞仪检测 2 4.2± 2 .4%CD34+3 4 细胞表达FasL(P <0 .0 1) (未转染的CD34+3 4 细胞FasL阳性率为 7.6± 1.1% )。结论　通过逆转录病毒途径 ,FasL基因可有效转染骨髓CD34+3 4 细胞