HPV16L1真核表达系统在哺乳动物细胞中表达的实验研究

人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus,HPVs)是引起人类皮肤、粘膜乳头状瘤或疣的一类肿瘤相关病毒 ,与多种肿瘤发生相关 ,至今尚无有效的预防方法。 70年代科学家们把乳头瘤病毒 (PV)分为人乳头瘤病毒 (HPV)和动物乳头瘤病毒 [1 ,2 ] ,现在已把 HPV分成 70余个型别 ,且确立了 HPV与肿瘤发生的相关性 ;把 HPV分成高危组、低危组 ,在高危组中以 HPV16、18、31、33、5 8等型为代表 ,主要引起子宫颈癌 [3 ] 、消化道癌、骨髓瘤等[4] 。Van.den B等对大量子宫颈癌标本进行检测后发现 ,HPVDNA阳性率在 90 %以上 ,HPV16型占 40 %～ 6…     

融合基因Tat—HPV16L1的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人乳头瘤病毒16型L1基因和蛋白转导肽基因Tat的融合表达载体,以大肠杆菌作为表达系统,探索制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗的新方法.方法:以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因,与原核表达载体pET28a连接,重组质粒再与自行设计蛋白转导功能片段Tat连接,经测序鉴定后转入大肠杆菌表达菌株DE3进行诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白.结果:融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,结果诱导表达成功.结论:本研究为制备经济而高效的人乳头瘤病毒疫苗打下了基础.     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

HPV L1壳蛋白表达与宫颈上皮瘤变及HPV分型的关系

目的分析HPV L1壳蛋白的表达与宫颈上皮病变的关系及其在HPV分型中的分布情况。方法对4 320例妇女进行宫颈液基细胞学(LCT)和HPV分型检测,对LCT≥无明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)或HPV阳性者行HPV L1检测,并对LCT≥ASC-US且HPV阳性者行阴道镜下组织病理学检查。结果对LCT≥ASC-US或HPV阳性者(共401例)进行HPV L1检测,HPV L1阳性率为34.9%(140/401)。对LCT≥ASC-US且HPV阳性者129例进行组织病理学检查,LCT与组织病理学诊断符合率为79.2%。HPV L1在LCT诊断为ASC-US、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)的患者中阳性率分别为40.2%(29/72)、69.2%(18/26)、9.0%(2/22)。386例HPV感染者中,单一型别感染率居前四位的是HPV52、58、16、18型,其HPV L1阳性率分别为53.3%、28.9%、12.2%、5.6%。结论 HPV L1阳性率随宫颈病变级别增高呈下降趋势,LCT联合HPV L1检测可为宫颈病变预后判定提供参考依据。     

鼠疫耶尔森菌caf1M基因的克隆表达及其产物免疫学评价

目的原核表达有免疫学活性的重组caf1M蛋白(rCaf1M),并以此建立检测鼠疫抗体的辅助诊断方法。方法将去掉信号肽编码序列的caf1M基因片段与载体pGEX4t-1通过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切位点进行连接,构建重组质粒caf1M-pGEX4t-1;将caf1M-pGEX4t-1转化入E.coliBL21(DE3)中诱导表达;表达产物rCaf1M经亲和层析进行纯化;以纯化rCaf1M及天然F1抗原喷制鼠疫抗体双检测NC膜,并以浙江各6份F1抗体阳性及阴性人血清标本进行应用评价。结果含有重组质粒caf1M-pGEX4t-1的BL21,经诱导产生了分子量约为55×103的rCaf1M融合蛋白;rCaf1M融合蛋白与鼠疫菌免疫血清有较好反应;在浙江人血清标本的检测中,rCaf1M与F1抗体阳性者有明显反应,与F1抗体阴性者无反应。结论本研究制备的rCaf1M,与鼠疫菌免疫血清具有良好的免疫反应性,该rCaf1M可用于鼠疫辅助免疫学检测。     

人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达载体的构建及表达

目的从感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长，构建表达载体，并验证目的蛋白的表达。方法根据基因全长设计一对特异引物，用PCR的方法从宫颈癌组织DNA，中获得L1基因，以pMD18T为克隆载体，构建重组质粒进行亚克隆，再以pcDNA3．1（＋）为载体构建表达质粒，转染至人肝细胞系H7702，提取蛋白，采用Western Blot方法检测HPV16-L1蛋白的表达。结果从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV16型L1蛋白编码序列与Genebank报道序列高度同源，其真核表达产物与特异性抗体能够特异性结合。结论成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-HPV16-L1，为进一步研制HPV预防性疫苗创造基础条件。     

鼠疫耶尔森菌caf1M基因的克隆表达及其产物免疫学评价

目的 原核表达有免疫学活性的重组caf1M蛋白(rCaf1M),并以此建立检测鼠疫抗体的辅助诊断方法。方法 将去掉信号肽编码序列的caf1M基因片段与载体pGEX4t-1通过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切位点进行连接,构建重组质粒caf1M-pGEX4t-1;将caf1M-pGEX4t-1转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达;表达产物rCaf1M经亲和层析进行纯化;以纯化rCaf1M及天然F1抗原喷制鼠疫抗体双检测NC膜,并以浙江各6份F1抗体阳性及阴性人血清标本进行应用评价。结果 含有重组质粒caf1M-pGEX4t-1的BL21,经诱导产生了分子量约为55103的rCaf1M融合蛋白;rCaf1M融合蛋白与鼠疫菌免疫血清有较好反应;在浙江人血清标本的检测中,rCaf1M与F1抗体阳性者有明显反应,与F1抗体阴性者无反应。结论 本研究制备的rCaf1M,与鼠疫菌免疫血清具有良好的免疫反应性,该rCaf1M可用于鼠疫辅助免疫学检测。     

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。     

FHIT和TSLC1基因在宫颈组织中的表达及其与HPV感染的关系

目的检测宫颈组织脆性组氨酸三联体(FHIT)基因与肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因表达,研究他们与宫颈癌发生及人类乳头瘤病毒(HPV)感染之间的关系。方法采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测正常宫颈组织20例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)20例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)45例及宫颈癌患者标本33例FHIT基因及TSLC1基因表达,同时检测这些标本中高危型HPV感染情况。结果正常宫颈组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中HPV的感染率、FHIT基因表达率及TSLC1基因表达率分别为0%、30%、71%和100%,100%、80%、36%和18%以及100%、75%、33%和24%。3项指标在不同宫颈组织之间差异有统计学意义(P<0.01)。所有FHIT基因与TSLC1基因表达缺失的患者均存在高危型HPV感染。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对宫颈癌及HSIL具有诊断价值。结论 FHIT基因与TSLC1基因在HPV感染之后、宫颈癌发生过程的早期阶段就可能发生表达缺失。对高危型HPV感染者进行FHIT与TSLC1基因表达检测,有可能成为宫颈癌早期诊断的重要参考依据。     

IL-1β诱导后NIT-1胰岛β细胞差异表达基因的克隆和BLAST分析

目的 通过分离IL-1β诱导后胰岛β细胞的差异表达基因，探讨细胞因子对胰岛β细胞的影响。方法 用RD-PCR技术分离差异表达基因，用Blast程序对差异基因进行序列分析。结果 通过RD-PCR技术分离得到41条明显表达差异的基因片段，其中14条为未知功能的新基因片段。结论 IL-1β诱导后，NIT-1β细胞的某些基因出现表达差异，这些基因可能参与了β细胞的破坏过程。     

人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的从尖锐湿疣病变组织中克隆人乳头瘤病毒6型(HPV6)E7基因,为HPV感染的检测及基因工程疫苗的研制奠定基础。方法以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术,从尖锐湿疣病变组织中扩增出人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架,并插入载体PMD-18T中构建重组质粒,转化JM109中扩增,进行酶切及测序分析。结果测序结果证实克隆成功。结论该实验为研究人乳头瘤病毒E7蛋白的免疫学和流行病学特点创造了条件,也为下一步制备HPV6型疫苗奠定了基础。     

Bcl—xL的基因克隆及其原核表达体系构建

目的克隆人Bcl—xL基因全长编码区,并利用载体pet28a在大肠埃希菌（ROS）原核表达人Bcl—xL蛋白,为探讨Bcl—xI。与肿瘤的关系奠定基础。方法分离胃癌患者外周血单核细胞并提取总RNA;采用RT—PCR方法扩增BclxL基因,构建重组表达质粒pet28a／Bcl—xL;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后增菌培养,IPTG25C诱导6h,SDS—PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白,进一步利用免疫印迹法鉴定。结果成功扩增获得Bcl—xL基因CDS区全长702bp,与GenBank中发表的序列完全一致;成功构建了原核表达载体pet28a／BclxL,并在工程菌ROs中获得大量表达。结论扩增获得人Bcl—xL基因,并成功原核表达获得人Bcl—xL融合蛋白,为进一步深入研究其生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１），经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实这些融合蛋白具有ＨＣＶ的特异抗原活性，提示这些融合蛋白可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机理的研究。     

人白细胞介素6缺失突变体的克隆、表达与纯化及其初步功能鉴定(英文)

利用人白细胞介素6(hIL-6)cDNA上Pst Ⅰ酶切位点,在不改变相位的情况下,缺失IL-6分子中127—174位氨基酸残基,以pBV220为表达载体构建并筛选出重组子pBV*-DIL-6,编码12kD的IL-6缺失突变体。带有缺失IL-6分子的重组表达载体转化E.coli HB101株,42℃热诱导后,菌体裂解物经SDS-PAGE鉴定,表明携有pBV*-DIL-6的受体菌在约12 kD位置有一特异条带,与理论推算值基本相符;表达的蛋白命名为rDIL-6。薄层扫描结果显示rDIL-6占菌体总蛋白的30％,实现了IL-6突变体在大肠杆菌中的高表达。重组蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA方法证明重组蛋白可与rIL-6R-28特异结合;另外利用只与IL-6结合的McAB CLB.IL-6/14证明rDIL-6能竞争性抑制IL-6与rIL-6R-28的结合,说明目的蛋白与IL-6竞争结合IL-6Rα。7TD1细胞学分析表明rDIL-6不具有IL-6支持杂交瘤细胞生长特性,高浓度的重组蛋白可以部分中和IL-6对7TD1细胞生长刺激作用,表明缺失突变体具有一定的拮抗作用。     

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7-2分子是共刺激信号系统B7/CD28/CTLA-4中的重要成员之一。为了更深入地探讨B7-2分子在调控T细胞增殖，分化及相关信号传导过程中的作用，本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码人B7-2分子胞外区的cDNA，测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达，用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明；通过pGEX-4T-2载体实现了在宿主菌BL-21（DE3）-codenplus-RIL中较高水平的表达，蛋白表达量为20%。经Western印迹和MTT鉴定，所表达及初步纯化的B7-2胞外区重组蛋白能与抗人B7-2单抗发生特异性结合；在抗人CD3单抗的协同下，B7-2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论：B7-2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7-2分子结构与功能的关系奠定了基础。     

人乳头瘤病毒、人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒感染与宫颈癌的关系

目的　本研究旨在探讨宫颈癌前病变和宫颈癌的发生发展与人乳头状瘤病毒及HSV、CMV的关系。方法　对81例不同宫颈病变组织进行HPV16 /18和HPV6 /11原位杂交,同时对98例不同宫颈病变组织用DNA扩增法检测HPV、HSV和CMV。结果　病毒DNA原位杂交信号的分布与HE染色中挖空细胞的分布一致。HPV16 /18与不同宫颈病变组织原位杂交阳性率平均为5 1 .1% ,HPV6 /11的则为6 4 .7%。HPV16 /18、HPV6 /11、HSV、CMV在不同宫颈病变组织中的阳性率分别为2 1%、4 %、2 3%、0 %。结论　HPV感染具有特定的组织学部位,HSV可协同HPV16 /18恶性转化宫颈上皮细胞。     

鹰潭地区女性宫颈 HPV 感染率及其基因分型特点

目的：探讨鹰潭地区女性宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染率及其病毒基因分型特点,为该地区宫颈癌防治提供更科学、可靠的临床数据。方法回顾分析2011年1月至2013年6月来鹰潭市人民医院铁路分院门诊妇科就诊及体检的妇女4165例,采用核酸扩增和反向点杂交技术对23种 HPV 基因型进行检测,然后对检测结果进行分析。结果在4165例患者中,HPV阳性者有1311例,感染率为31．48％;一重感染率为20．86％,二重感染率为6．27％,三重感染率为2．76％,四重感染率为0．84％,四重以上感染率为0．72％。感染率最高的基因型别是 HPV 52型,占12．43％,其次为 HPV 43、58、16型。＞20～25岁者感染率最高,为43．19％。结论鹰潭地区女性宫颈 HPV 感染率有较高的区域性,以 HPV 52、43、58、16等亚型感染居多。     

HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配

目的大量表达和纯化HPV58衣壳蛋白,形成病毒相似颗粒。方法制备携带HPV58L1和L2基因的重组杆状病毒,转染昆虫细胞,在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白并进行纯化。电镜观察病毒相似颗粒的形成情况。免疫小鼠制备特异性抗血清。结果 HPV58L1和L2蛋白在真核细胞中被高效表达,电镜下见表达纯化的病毒衣壳蛋白L1与L2共同组装形成病毒相似颗粒(VLPs),用其免疫小鼠能产生针对HPV58L1蛋白的高滴度的特异性抗体。结论在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白,纯化后能形成病毒相似颗粒,并具备很强的免疫原性,有望用其制作宫颈癌预防性疫苗。     

Cloning of two novel P450 cDNAs from German cockroaches, Blattella germanica (L.): CYP6K1 and CYP6J1

Two novel P450 cDNAs, CYP6K1 and CYP6J1, were isolated from German cockroaches, Blattella germanica (L). Both CYP6K1 and CYP6J1 are typical microsomal P450s and their deduced amino acid sequences share a number of common characteristics with other members of the P450 superfamily. Both CYP6K1 and CYP6J1 showed the highest per cent identity (based on the deduced amino acid sequence) to CYP6L1 from B. germanica and CYP6H1, a putative ecdysone 20‐hydroxylase from Locusta migratoria. Using a CYP6K1 probe, two mRNA signals (~2.5 and ~2.1 kb) were detected in all life stages. Both signals were just detectable in the eggs and became stronger in later instars. The strongest signals were detected in the fifth and sixth instars as well as in adults. These two bands were also detected in the abdomens and in the remainder of bodies of both male and female adults. Southern blots suggest the two mRNA bands detected in the Northern blot might be a result of alternative splicing. No signal could be detected at any life stage using the CYP6J1 probe, suggesting that CYP6J1 was expressed at a low level.