小鼠巨细胞病毒即刻早期基因M122酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AH109菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库。方法采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的M122基因片段,并将其插入到pMD18-Tsimple vector,构建重组质粒pMD18-T-M122。用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将重组质粒酶切鉴定,并测序。测序正确的pMD18-T-M122重组质粒和载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,凝胶回收M122基因片段及pGBKT7-BD载体片段。将回收的M122基因片段和pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122。对pGBKTT-M122进行酶切鉴定,测序。将测序正确的pGBKT7-M122转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于营养缺陷培养基SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal平板。空载体质粒pGBKT7-BD和阳性质粒pCL作为对照亦被转入AH109酵母感受态细胞,转化菌液分别涂布于SD/-Trp平板和SD/...     

筛选与分析与人巨细胞病毒UL133编码蛋白相互作用的蛋白

目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础.方法 设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增 HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7 同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒 pGBKT7-UL133,并测序分析.利用醋酸锂小量酵母转化方法,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,进行回转验证.对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长.转化有人胎脑cDNA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆.通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性氧化还原酶1.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用.     

鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP(38-94)反应质粒的构建

目的 免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞,克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP(38-94)基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(38-94).方法 采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞,分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(38-94)基因片段,扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞;经限制性内切酶Barn H I、Not Ⅰ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的 基因已经插入重组质粒.结论 运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞;成功克隆PTHrP(38-94)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(38-94),为进一步明确PTHrP(38-94)片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.     

人胰岛素样生长因子1基因质粒载体的构建及其在人脐血源性神经干细胞中的表达

目的 构建人胰岛素样生长因子1(IGF-1)质粒表达载体,并观察重组体pcDNA3.1-IGF-1转染后的脐血源性神经干细胞(NSCs)中IGF-1基因的表达情况.方法 通过反转录-PCR(RT-PCR)方法从胎肝中提取IGF-1基因,胶回收方法分别纯化PCR产物(IGF-1基因)和质粒pcDNA3.1,二者分别由DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切后,经T4 DNA Ligase连接的方法将IGF-1基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1中,采用测序方法及DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-IGF-1及空质粒pcDNA3.1分别转染至脐血源性NSCs内,经G418抗性筛选后,利用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测IGF-1基因在基因转染脐血源性NSCs内的表达情况.结果 IGF-1基因从胎肝中成功提取.重组体pcDNA3.1-IGF-1经基因测序及DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1构建正确.重组体经脂质体法转染脐血源性NSCs 24 h后,经G418筛选2周得到细胞抗性克隆,免疫细胞化学法检测到IGF-1基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中成功表达.RT-PCR方法检测到重组质粒pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中IGF-1 mRNA表达阳性,而空质粒pcDNA3.1转染的脐血源性NSCs中IGF-1 mRNA表达阴性.结论 IGF-1基因可在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs内成功表达.     

婴幼儿小肠组织全长cDNA文库的构建及鉴定

目的 构建婴幼儿小肠组织全长cDNA文库,为进一步通过酵母双杂交方法搜寻与轮状病毒VP4蛋白相互作用的宿主细胞受体蛋白提供必要条件.方法 2006年11月至2007年9月从婴幼儿小肠组织中提取总RNA,并纯化mRNA,反转录合成第1链,连接EcoRI人工接头,分级分离后,除去小于500bp cDNA片段,与质粒pUra-M△polyA连接后,氯化钙法转化感受态细胞DH5α,测定文库大小并利用EcoRI-XhoI双酶切鉴定插入cDNA片段的大小.结果 构建成含有6×107重组子的婴幼儿小肠组织cDNA文库,插入片段的大小范围在0.5～2.0kb之间,平均长度1.5kb.结论 构建的文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.     

幽门螺杆菌儿童分离株尿素酶基因B的克隆及序列分析

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)临床儿童分离株尿素酶B(UreB)基因入pGEX-4T-1表达载体,并进行测序及基因比对分析,为以UreB作为Hp疫苗分子的口服疫苗研制奠定基础。方法根据GenBank中HpUreB序列,设计一对特异性引物PCR扩增Hp临床儿童分离株UreB全长基因,EcoRI及NotI酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及基因测序,并对测序结果进行比对分析。结果以Hp儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了UreB基因,基因大小为1710bp,重组pGEX-4T-1-Ure双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示UreB在正确阅读框中,序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%。Hp儿童分离株GZCH1UreB序列已登录GenBank(登录号:FJ455126)。结论从Hp儿童分离株GZCH1中成功克隆了UreB基因,为UreBHp口服疫苗研制奠定了基础。     

大鼠肺表面活性蛋白C基因的克隆及原核表达

目的构建高氧下早产大鼠肺表面活性蛋白C基因原核表达质粒,实现其在大肠杆菌中的表达。方法孕21 d SD早产大鼠,生后12 h暴露于85%高氧中,7 d后处死,取肺组织,提取RNA,并合成cDNA,进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,经过酶切和测序验证,成功构建原核表达载体pET-28a(+)-sp-c,重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析检测表达产物。结果经酶切和测序验证,成功构建pET-28a(+)-sp-c质粒,高效表达出相对分子质量21 000的融合蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达SP-C重组融合蛋白,有助于研究SP-C蛋白与内质网之间的作用机制、SP-C错折叠蛋白在肺上皮A549细胞中的表达以及对AECⅡs增殖、分化及凋亡的影响。     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).     

RNA干扰对人神经母细胞瘤VEGF-A表达的抑制作用

目的 构建VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y VEGF-A的表达.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒psc001、psc002,对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证并经Western Blot筛选,然后将筛选所得的质粒转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y.转染48h后行Annexin V和PI双重标记流式细胞仪检测转染细胞凋亡情况,ELISA检测VEGF-A蛋白的表达水平.结果 PCR和测序证实寡核苷酸片段已成功插入质粒psc001、psc002中,流式细胞仪检测结果 显示转染的外源基因未引起显著的神经母细胞瘤细胞凋亡,ELISA结果 显示转染后细胞株SH-SYSY的VEGF-A蛋白表达受到显著抑制(P<0.05).结论 成功构建人VEGF-A的短发卡RNA真核表达载体,转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后能显著抑制VEGF-A的表达,但没有引起显著的细胞凋亡(P0.05).