Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究

目的：对Ad－BMP－2／GFP转染兔骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT 法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot 检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs ,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。 Ad－BMP－2／GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs 的增殖（P＜0．05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP－2目的蛋白。结论 Ad－BMP－2／GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

狗骨髓基质细胞的体外诱导成骨潜能研究

目的：观察狗骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法：采用成年狗双侧髂骨取材进行骨髓基质细胞培养，应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法观察细胞增殖；以对硝基苯磷酸盐法及骨钙素含量放免测定法测定碱性磷酸酶活性及骨钙素含量；用Von Kossa染色法观察矿化结节；用间接免疫荧光染色法测定Ⅰ型胶原。观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果：骨髓基质细胞呈成纤维样表现，增殖力强。诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素含量明显增高，Ⅰ型胶原表达增多，10～12d达到高峰，并出现矿化结节。结论：狗骨髓基质细胞在本实验条件下，成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

人胎盘间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力的研究

目的通过体外分离纯化人足月胎盘间充质干细胞(hPMSCs),以研究其生物学特征及成骨能力。方法 采用胶原酶消化贴壁培养及人淋巴细胞分离液从人足月胎盘中分离纯化间充质干细胞(MSCs);流式细胞仪检测其细胞表面标志物的表达并运用MTT测定细胞生长曲线;电镜观察细胞超微结构;地塞米松、维生素C与β-甘油磷酸钠联合诱导其向成骨细胞分化,碱性磷酸酶及茜素红染色检测其碱性磷酸酶活性及钙结节。结果培养14天后可见大量贴壁细胞呈成纤维状生长,传代后增殖能力显著增强;强表达CD44,CD29,不表达CD34,CD45;经诱导后具有向成骨细胞分化的潜能,茜素红及碱性磷酸酶染色结果阳性。结论 人足月胎盘中同样含有MSCs,与其他来源的MSCs生物学特性相似,并且具有向中胚层细胞分化的能力,可作为组织工程及细胞替代疗法新的干细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

小鼠胎肝间充质干细胞的体外成骨诱导及复合陶瓷化骨的实验研究

目的探讨小鼠胚胎肝脏间充质干细胞的体外分离培养方法，并观察其成骨分化潜能及与陶瓷化骨支架材料的复合能力。方法将小鼠胎肝组织制成单细胞悬液行原代和传代培养，流式细胞仪检测其表面标志。用化学成骨诱导体系对纯化的胎肝间充质干细胞行成骨诱导，并进行成骨功能检测。将其与经过Ⅰ型胶原表面改性的陶瓷化骨复合培养，观察细胞在其上的黏附生长情况。结果原代培养的胎肝间充质干细胞，具有集落形成能力，为梭形或多角形。易于传代，传代细胞与原代细胞大小、形态相似。流式细胞仪检测表明，传代后的细胞CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性，表达间充质干细胞的特征标志。成骨诱导7d后碱性磷酸酶染色可见有较多阳性细胞，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性；14d后，细胞碱性磷酸酶活性定量检测明显增高；28d后，矿化结节染色呈阳性。将细胞与经胶原表面改性后的煅烧陶瓷化骨复合培养。扫描电镜见载体上有大量细胞黏附于材料表面。结论小鼠胎肝间充质干细胞易于获取及传代；体外成骨诱导后可向成骨细胞方向分化；能在陶瓷化骨支架材料上黏附生长。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

从少火生气理论探讨肾气丸促巨噬细胞M2型极化影响成骨的作用

目的 基于少火生气理论探讨肾气丸原组方（SQW）和肾气丸去除桂枝、附子（SQQ）诱导巨噬细胞M2型极化对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）成骨分化作用的效果差异。方法 采用CCK8法分别检测SQW、SQQ对RAW264.7细胞存活率的影响，以确定药物干预的安全作用浓度。将RAW264.7细胞分为CON组、IL-4组、IL-4+SQW组、IL-4+SQQ组。将不同药物组诱导巨噬细胞M2型极化后分泌的细胞上清液作为条件培养基培养BMSC，评估BMSC成骨分化的能力。用碱性磷酸酶染色法（ALP）及茜素红染色法（ARS）检测各组BMSC成骨分化能力；使用免疫荧光技术（IF）检测BMSC成骨标志蛋白骨形态发生蛋白4（BMP4）、骨保护素（OPG）的分布和表达；使用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测M2型巨噬细胞极化相关的精氨酸酶1（ARG1）、白细胞介素10（IL-10）的表达以及BMSC成骨相关的BMP4、RUNT相关转录因子2（RUNX2）的表达。结果 与IL-4+SQQ组相比，IL-4+SQW组更加显著促进M2型巨噬细胞极化相关因子ARG1、IL-10上调（P＜0.01），且其条件培养基培养的BMSC的ALP及ARS染色增强，成骨蛋白BMP4、OPG、RUNX2表达升高（P＜0.05）。结论 肾气丸原组方与肾气丸去除桂枝、附子两味药相比，具备更强的促进巨噬细胞M2型极化与增强BMSC成骨分化能力，为少火生气理论提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及在精原细胞培养条件下生物学特征的观察

目的体外分离、培养、纯化小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并观察MSCs在精原细胞培养条件下的生物学特征,为体内诱导MSCs分化为精原细胞奠定基础。方法①分离5～6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs;②通过动态观察、苏木精伊红(HE)染色、透射电镜观察、免疫组化检测细胞表面标记等鉴定MSCs;③用ELISA法检测MSCs培养上清中白细胞介素6(IL6)、IL8、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子的相对含量,与相应对照组比较;④取第3代MSCs,分组进行诱导培养观察,对照组用基本培养液培养MSCs,实验组用条件培养液诱导培养MSCs。通过显微镜下动态观察、HE染色、免疫组化等方法观察诱导结果。结果①获得纯化的MSCs;②动态观察培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,HE染色细胞呈梭形,透射电镜观察细胞较幼稚,免疫组化检测细胞表面标记CD44、CD90呈阳性,从而鉴定了MSCs;③MSCs培养上清中IL6、IL8、G CSF、SCF等的含量显著高于对照组(P<0.05);④实验组细胞形态发生变化,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阳性;对照组细胞形态不变,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阴性。结论①用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法可获得纯化的MSCs;②     

人骨髓基质细胞培养及向成骨细胞的诱导分化

目的研究人骨髓基质细胞体外培养及向成骨细胞诱导分化的实验方法。方法采用梯度离心法获得人骨髓基质细胞，细胞纯化后使用分化培养液将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法，确定细胞的功能状态和分化程度。结果显微镜观察显示获得的人骨髓基质细胞生长状况良好，生化指标稳定；经分化培养液培养的细胞增殖速度明显减慢，生长状态平稳。细胞在分化培养过程中，上清液中碱性磷酸酶分泌量明显增加，细胞碱性磷酸酶染色明显浓染，随时间呈显著增强趋势；采用常规培养液培养的骨髓基质细胞，在汇合后不能形成明显的矿化结节。用分化培养液培养的人骨髓基质细胞，在14d时开始出现矿化结节，在21d时呈现密集的茜素红染色矿化结节。结论梯度离心法获得的人骨髓基质细胞生长情况良好，功能状态稳定；体外培养的人骨髓基质细胞在一定条件下可以向成骨细胞方向诱导分化，并具有良好的成骨细胞功能特征，可以满足进一步研究的需要。     

大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。     

菲立磁细胞内标记兔骨髓基质细胞的初步观察

目的:探讨利用菲立磁(Fefidex)和转染试剂体外标记兔骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础.方法:9只2月龄新西兰大白兔无菌条件下行股骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞,用菲立磁-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)标记骨髓基质细胞,采用普鲁士蓝染色和台盼蓝拒染实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并在增殖条件下用改良SABC法进行抗单克隆神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色(DAB-H<,2>O<,2>棕色法呈色)和普鲁士蓝(Prussian blue)染色.对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估.结果:菲立磁可以高效率地标记兔骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.普鲁士蓝染色显示FE-PIJL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.标记的骨髓基质细胞与正常未标记细胞相比较,细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的差异.结论:菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞,标记后对骨髓基质细胞活力、增殖和分化能力无明显影响.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化研究的体外实验

目的 分离培养较高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,检测其多向分化潜能.方法 采用密度梯度离心结合差速贴壁法分离培养大鼠BMSCs,观察细胞形态,检测表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90表达情况,及其成骨、成脂、成神经诱导后茜素红染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色情况.结果 细胞呈典型的成纤维细胞样形态,CD44和CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达,细胞纯度＞98%.成骨、成脂、成神经诱导后,茜素红染色、油红O染色、NSE和GFAP免疫荧光均为阳性.结论 密度梯度离心结合差速贴壁法可分离、培养出高纯度的大鼠BMSCs,该细胞具有成脂、成骨、成神经多向分化潜能,是脊髓损伤修复的一种较理想的种子细胞.