猕猴骨髓基质干细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的 通过体外分离、培养猕猴骨髓基质干细胞(BMSCs)，研究其生物学特性、表面标志和遗传学性能，为BMSCs用作组织工程化神经种子细胞提供研究基础。方法 通过密度梯度离心分离猕猴BMSCs，体外培养、扩增，用倒置相差显微镜进行形态学的观察，通过绘制生长曲线、计算克隆形成率来研究细胞的活力和增殖能力，流式细胞仪检测表面标志，核型分析反应遗传学性能。结果 密度梯度离心的方法能获得较纯的猕猴BMSCs，第7代以前的细胞有较强的活力和增殖能力，具有与人的BMSCs相似的形态和表面标志，体外培养第10代细胞仍稳定为二倍体核型。结论 用本实验方法能较容易地获得大量的猕猴BMSCs，具有与人的BMSCs相似的形状和表面标志，第3—6代的细胞可满足以猕猴为动物模型的组织工程化神经种子细胞的研究要求。     

兔骨髓基质细胞的分离培养

目的 为骨组织工程寻找一种理想的种子细胞。方法 采取兔骨髓组织，应用梯度离心获取骨髓基质细胞，体外培养传代，通过光镜、透射电镜及成骨特性的鉴定，观察细胞的形态、生长特点及成骨特性。结果 培养的骨髓基质细胞形态多为三角形或梭形，生长增殖迅速，具有成骨能力，易于定向分化为成骨细胞。结论 自骨髓获得的骨髓基质细胞具有明显的增殖能力和成骨活性，可以做为骨组织工程中比较理想的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

骨髓基质干细胞的研究进展

随着细胞治疗的发展,骨髓基质干细胞的基础和临床应用研究日益受到重视。本文对骨髓基质干细胞生物学特性、临床前期研究成果和面临的问题进行了综述。     

体外培养版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞的生物学特性

目的　分离培养成年版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法　成年版纳微型猪骨髓基质干细胞通过密度梯度离心法分离获得 ,用含 15 %小牛血清的 DMEM在 37℃ ,5 % CO2 条件下培养 ;通过克隆生长特性、特异抗原表达和成骨分化能力鉴定其干细胞特性。结果　版纳微型猪近交系骨髓分离获得的基质干细胞具有多种形状 ,但主要为梭形。其具有很强的增殖能力 ,在体外培养条件下可以观察到明显的克隆样生长 ;表达 SH2、SH3、SH4、SB10和 SB2 1等骨髓基质干细胞的特异标记 ;经成骨添加剂诱导培养之后能分化为成骨细胞 ,碱性磷酸酶活性增强并具有细胞外基质矿化能力。结论　成年版纳微型猪近交系骨髓来源的基质干细胞具有干细胞的一般生物学特性     

成年恒河猴骨髓基质干细胞的体外培养

目的温对猴骨髓基质干细胞(BMSCs)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。方法 抽取4只成年猴髂骨骨髓，用全骨髓培养法进行体外培养获得BMSCs，胰酶消化传代，用条件培养基培养传代细胞。逐日倒置显微镜观察细胞生长情况，对传代细胞进行HE染色及碱性磷酸酶(ALP)染色。结果 成年雄性恒河猴BMSCs体外培养生长良好，原代细胞10-13d汇成单层，传代后4～7d长满瓶底。HE染色光镜下观察见BMSCs为单核细胞，细胞呈梭形、多角形，传代细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。结论 猴BMSc的体外培养增殖能力强，可诱导为成骨细胞，可作为灵长类动物骨组织工程的种子细胞。     

骨髓基质干细胞体外培养及临床应用研究

目的 :通过对人骨髓基质细胞的体外培养、扩增和初步回植的研究 ,探讨MSCs临床应用疗效和前瞻性。方法 :从人髂骨抽取骨髓液 ,体外培养、传代和扩增 ,细胞周期、细胞形态和细胞分裂方式观察 ,并初步对骨科疾病进行回植治疗。结果 :建立一套完整、简单、成熟的体外分离、培养、扩增MSCs的系统方法 ,获得初步良好的临床疗效。结论 :人骨髓基质细胞能在体外大量培养扩增 ,为今后的理论研究和临床应用奠定了基础     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

兔骨髓间充质干细胞生物学特性的探讨

骨髓中存在具有多胚层分化能力的骨髓间充质干细胞（BMSCs），本实验旨在通过探讨BMSCs在低营养环境的生存能力，及地塞米松（DEX）对其增殖和碱性磷酸酶（ALP）表达的影响，为BMSCs在骨组织工程的临床应用研究提供依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性.方法 取大鼠股骨和胫骨,以Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,MTT法测定细胞的生长曲线,流式细胞仪细胞表面抗原.结果 原代分离的BMSCs,培养48 h开始贴壁,胞体由圆形变为椭圆形、多角形或短梭型;培养第12天,见胞体渐变为长梭型,并达90%单层融合;经传代扩增,细胞进一步纯化.7代以前,细胞在2 d内处于潜伏期,第3天进入对数生长期,第7天进入平台期;10代后增殖速度变慢;流式细胞仪鉴定BMSCs表而抗原,CD44、CD90、CD34阳性率分别为99.62%、95.13%、2.06%.结论 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法有效分离纯化大鼠BMSCs,且细胞生长稳定,增值能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性.     

体外诱导骨髓间质干细胞向软骨方向分化的研究

目的　探讨体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs)向软骨方向分化的条件和方法。方法　抽取兔股骨骨髓 ,用密度梯度离心和贴壁分离法分离BMSCs ,分别在高密度 (1× 10 6/ml)和低密度 (1× 10 4/ml)培养条件下用转化生长因子 β1(TGF β1)诱导BMSCs向软骨方向分化。倒置显微镜、透射及扫描电子显微镜观察细胞 ,用免疫组织化学、原位杂交、特殊染色方法检测Ⅱ型胶原及软骨基质成分的表达。结果　高密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阳性率为 89.2 %,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 82 .6%,黏多糖特殊染色阳性 ,低密度诱导的BMSCsⅡ型胶原免疫组织化学阴性 ,Ⅱ型胶原原位杂交阳性率为 3 .8%,黏多糖特殊染色阴性。结论　TGF β1可以诱导BMSCs向软骨方向分化 ,细胞密度是BMSCs分化的重要影响因素。     

骨髓间充质干细胞及其诱导成骨的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织[1],如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力[2-3],这些细胞经过20～30个培养周期,仍能保持多向分化潜能。无论是自体的还是同种异源的BMSCs,一般都不会引起宿主的免疫反应。BMSCs以其来源充足、取材简便、对供体损伤小、易于分离培养、体外增殖能…     

体外培养对人骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的了解体外培养对人骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学行为的影响。方法MSCs来自5个不同个体。体外培养扩增传代后。取2代细胞6份、3代细胞9份、9代细胞2份进行形态学观察和细胞周期检测;取1代细胞2份、2代细胞3份、3至6代细胞各1份进行刀豆蛋白A(ConA)凝集试验;另取第3、9代细胞各1份,接种于严重联合免疫缺陷小鼠,分别在接种后第1、2、3、4周进行大体观察并取接种部位组织进行显微镜下观察。结果随着体外培养时间增加,细胞增殖变缓,体积变大。S期细胞数增高,G0～G1期细胞数减少。但所有检测细胞均为二倍体。ConA试验均未发现细胞凝集。不同培养时间细胞皮下接种均未见有炎性细胞浸润,但局部有胶原组织形成,至第4周消失。结论长期体外培养,细胞增殖能力降低,但并不会引起培养细胞发生恶性变。     

In utero transplantation of human bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells in mice.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that can be isolated from human bone marrow and possess the potential to differentiate into progenies of embryonic mesoderm. However, current evidence is based predominantly on in vitro experiments. We used a murine model of in utero transplantation (IUT) to study the engraftment capabilities of human MSCs. MSCs were obtained from bone marrow by negative immunoselection and limiting dilution, and were characterized by flow cytometry and by in vitro differentiation into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. MSCs were transplanted into fetal mice at a gestational age of 14 days. Engraftment of human MSCs was determined by flow cytometry, polymerase chain reaction, and fluorescence in situ hybridization (FISH). MSCs engrafted into tissues originating from all three germ layers and persisted for up to 4 months or more after delivery, as evidenced by the expression of the human-specific beta-2 microglobulin gene and by FISH for donor-derived cells. Donor-derived CD45+ cells were detectable in the peripheral blood of recipients, suggesting the participation of MSCs in hematopoiesis at the fetal stage. This model can further serve to evaluate possible applications of MSCs.     

同种异体血清在体外培养骨髓间充质干细胞的作用研究

[目的]适当的血清浓度可维持骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养,血清浓度过低不利于细胞的生长,而高浓度血清则易引起细胞分化。而血清的不同来源对MSCs的培养同样产生影响。传统的培养方法用胎牛血清作为营养支持,临床应用时存在潜在的风险。本研究探讨同种异体血清在体外培养人骨髓间充质干细胞(hBM-SCs)的可行性。[方法]无菌条件下收集人骨髓悬液,分离hBMSCs,分别用含胎牛血清和人血清的培养基培养。分别测定2种方法培养的hBMSCs细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测分析培养的hBMSCs表面抗原类型;并将培养的hBMSCs诱导分化为软骨细胞及神经细胞,诱导后的软骨细胞及神经细胞采用免疫组化染色分析。[结果]2种方法培养的间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性,表达强度无显著性差异;人血清培养的hBMSCs细胞生长速度快于胎牛血清培养组,但分化效率低于后者。[结论]通过生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,人血清培养hBMSCs与胎牛血清培养差别不大,可以作为一种适合临床的安全培养方法。     

人脂肪组织与骨髓来源间充质干细胞生物学特性的比较

目的 比较脂肪来源间充质干细胞(ADAS)和骨髓来源间充质干细胞(BMSC)的生物学特性.方法 分离ADAS和BMSC,比较它们的表型、细胞倍增时间及分泌的相关因子,分别检测它们对T淋巴细胞的活化、细胞周期、增殖及凋亡的作用.结果 BMSC和ADAS在细胞表型上类似,只有CD106的表达有差异;在增殖速率上,ADAS群体倍增时间为28 h,显著高于BMSC的39 h(P＜0.05);ADAS和BMSC同样具有抑制T淋巴细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T淋巴细胞增殖中,这种抑制作用都具有剂量依赖性,在1:2时抑制作用极强,但是在1:100时这种抑制作用基本消失;在共培养时,ADAS和BMSC都可以使绝大多数的T淋巴细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T淋巴细胞的早期活化,但是ADAS的上述作用均比BMSC弱;ADAS并不具有抑制T淋巴细胞凋亡的作用,而在TH0细胞向TH 1细胞或TH2细胞分化中所起的作用基本相似,主要抑制TH0细胞向TH1细胞(表达IL-2和IFN-γ的T淋巴细胞)的分化,而对向TH2细胞(表达IL4和IL-10的T淋巴细胞)分化没有明显的影响.结论 ADAS与BMSC具有类似的免疫调节作用,在相同体积的脂肪组织中能够得到的干细胞前体细胞的数量是骨髓组织的10倍以上,因此ADAS较难以获得的BMSC更有广泛的应用前景.     

诱导小鼠骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞的定向分化

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞是否能够在体外被诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。方法从雄性小鼠骨髓中分离能够长期贴壁生长的细胞,并鉴定其是否为间充质干细胞。对分离的细胞进行生殖细胞特异性报告基因标记(stra-8-GFP)。采用视黄酸诱导标记的细胞发生向生殖细胞方向的分化。通过观察报告基因表达和生殖细胞相关基因mRNA表达情况确定是否发生了分化。结果从小鼠骨髓中分离到的贴壁生长的细胞表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD44、CD105和Sca-1;细胞在体外可以被诱导分化为成骨、成软骨及成脂肪细胞。报告基因标记的间充质干细胞在被视黄酸诱导2d后开始表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因Mvh、Fragilis和Stella的mRNA。未经视黄酸诱导的细胞不表达绿色荧光蛋白和生殖细胞相关基因。结论小鼠骨髓间充质干细胞在体外可以被视黄酸诱导发生向雄性生殖细胞方向的分化。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。