心脏基因工程研究对一级康复的干预作用：构建柯萨奇B2病毒毒粒蛋白候选基因疫苗诱导体液免疫的评估

目的：探讨心脏基因工程研究中构建柯萨奇B2病毒毒粒蛋白侯选基因疫苗，并评价其诱导体液免疫的效果：方法：实验于2003—05／12在中国农业科学院国家生物重点实验室哈尔滨兽医研究所生物二室完成。采用反转录聚合酶链反应技术扩增柯萨奇B2病毒的主要中和抗原毒粒蛋白基因，通过分子克隆构建pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白基因免疫质粒。选择3周龄BALB／c雄性小鼠30只，随机分成3组，pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白组：对小鼠进行pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白免疫；空载体对照组对小鼠进行pcDNA3免疫；磷酸盐缓冲液组：对小鼠进行磷酸盐缓冲液免疫，每组10只。每组免疫时间和接种量、接种方法相同。采用酶联免疫吸附法测定pcDNA3．柯萨奇B2病毒毒粒蛋白、pcDNA3、磷酸盐缓冲液免疫小鼠后2，4，6，8周柯萨奇B2病毒特异性抗体免疫球蛋白C水平。结果：①获得pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白基因免疫质粒，可在HeLa细胞中表达。②免疫后6，8周pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白组柯萨奇B2病毒特异性抗体免疫球蛋白G水平明显高于免疫后4周似4靠0．153&;#177;0．013，0．150&;#177;0．011，0．142&;#177;0．014，P〈0．01，0．05）；免疫后4周pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白组柯萨奇B2病毒特异性抗体免疫球蛋白G水平明显高于空载体对照组和磷酸盐缓冲液组（0．120&;#177;0．007，0．119&;#177;0．009．P〈0.011。结论：pcDNA3-柯萨奇B2病毒毒粒蛋白可诱导小鼠产生体液免疫，做为候选基因疫苗，以基因免疫的角度参与心脏基因工程研究．有望为该病毒性心肌炎的发生起到一级预防作用。     

不同免疫类型的柯萨奇病毒DNA疫苗免疫效果研究

柯萨奇病毒B组3型（CoxsackievimsgroupBtype3，CVB3）是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体，目前还没有特异性的防治措施。我们将巨噬细胞源趋化因子（macrophage—derivedchemokine，MIC）基因和志贺毒素（Shigatoxin，STx）B亚单位基因分别与CVB3VP1基因融合构建DNA疫苗pcDNA3／MDC-VPI和pcDNA3／SYxB—VPI，免疫小鼠，用7LD30CVB3致死攻击，比较两种疫苗的免疫效果，为柯萨奇病毒疫苗的研制奠定试验基础。     

IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响

目的:观察IL-2、IFN-γ和GM-CSF重组质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果。方法:将50只4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/m IFN-γ组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组,每组10只。均每3周接种1次,共3次。每次接种的第20d内眦静脉采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:各组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P0.05);第3次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度、脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均高于其他组(P0.05)。结论:三种细胞因子基因佐剂均能增强pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,GM-CSF基因佐剂的免疫效果优于IL-2和IFN-γ。     

黄芪、牛磺酸抗病毒作用的定量PCR比较

目的 :研究黄芪、牛磺酸对鼠心肌炎模型心肌及血中病毒含量的影响。方法 :40只BALB/c小鼠随机分为 4组 ,正常对照组 ,黄芪治疗组 ,牛磺酸治疗组及非治疗病毒感染对照组。运用定量PCR方法检测肠病毒RNA含量。结果 :黄芪和牛磺酸减少了柯萨奇B3 病毒感染所致心肌炎BALB/c小鼠的死亡率。黄芪和牛磺酸减少了心肌炎BALB/c小鼠心肌及外周血中肠病毒RNA水平。黄芪、牛磺酸治疗组与非治疗病毒感染组血中肠病毒含量分别为 0 71± 0 0 9、0 88± 0 0 9、1 82± 0 0 9,心肌中肠病毒含量分别为 0 70± 0 0 7、0 81± 0 0 7、1 73± 0 0 9,前两组与后一组比较 ,血及心肌中肠病毒含量差异均有显著性 (P <0 0 1)。结论 :黄芪、牛磺酸对柯萨奇B3 感染所致心肌炎BALB/c小鼠有抗病毒作用     

同基因背景小鼠核蛋白诱导狼疮鼠模型

背景:自发性狼疮鼠模型不能对基因以外其他的致病因素进行研究。目的:以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫小鼠后诱导狼疮鼠模型。方法:选取4～6周SPF级Balb/c小鼠30只,等分为3组。V1组肌肉注射提取的同系Balb/c小鼠核蛋白,间隔3周免疫1次,共免疫4次;V2组注射等体积PBS;V3组为正常对照。检测小鼠末次免疫后3周的24h尿蛋白、血清抗核抗体、抗双链DNA抗体、小鼠肾脏直接免疫荧光。结果与结论:V1组小鼠24h尿蛋白、血清抗双链DNA抗体、抗核抗体均明显高于V2组、V3组,且V1组小鼠肾小球有免疫球蛋白G免疫复合物沉积,可见肾小球轮廓,V2组、V3组未见肾小球轮廓,只见非特异性的微弱荧光。说明以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫Balb/c小鼠能够成功诱导狼疮鼠模型。     

综合内科护士柯萨奇病毒感染情况及预防措施

目的 :了解综合内科护士柯萨奇病毒感染的情况。方法 :检测综合内科护士 2 4例及献血员 2 4例抗柯萨奇病毒B组的IgG抗体。结果 :护士组感染率高于献血员对照组。结论 :根据柯萨奇病毒的生物特性采取有效措施 ,加强医护人员自我保护意识 ,采取相应的预防措施 ,可减少医护人员感染柯萨奇病毒的几率     

柯萨奇病毒B4 2B基因siRNA达载体的构建及其对柯萨奇病毒B4抑制作用的研究

目的构建针对柯萨奇病毒B4 2B基因的siRNA表达载体并检测该载体在体外培养细胞中对柯萨奇病毒B4的抑制作用.方法选择柯萨奇病毒B4的2B基因区21bp的基因片段作为靶序列,合成含有靶序列的DNA片段并克隆到pGCsi-U6/Neo/GFP/siNeGative载体中,构建pGCsi-U6/Neo/GFP/2B,使其可表达具有发夹结构的双链siR-NA,在转染该载体后用柯萨奇病毒B4攻击Hela细胞,检测该载体对病毒感染细胞的保护效应.结果通过酶切、电泳、序列分析及荧光显微镜观察证明载体构建成功,而且pGCsi-U6/Neo/GFP/2B转染组的柯萨奇病毒B4的滴度及TCID50都明显低于pGCsi-U6/Neo/GFP/siNeGative转染组.结论成功构建了柯萨奇病毒2B基因的siRNA表达载体,而且该载体在体外培养细胞中对柯萨奇病毒的复制具有抑制作用.     

实验性病毒性心肌炎小鼠中核因子κB、单核细胞趋化蛋白-1的表达及意义

目的:探讨核因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)活化、单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)表达在小鼠病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)中的作用。方法:Balb/c小鼠40只随机分为2组:柯萨奇病毒B3(thecoxsack-ievirusB3,CVB3)感染组和对照组。分别在实验第7,14和21天处死动物,免疫组化检测心肌组织中NF-κB活化和MCP-1表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌组织中MCP-1mRNA的表达,双抗体夹心ELISA法检测血清MCP-1含量。结果:①感染组小鼠心肌组织中NF-κB活化、MCP-1表达均较对照组明显增强(P<0.01),第14天达高峰,阳性信号指数分别为(38.28±8.25)和(28.47±4.36),且与心肌病变呈正相关。②感染组小鼠MCP-1mRNA的表达量明显增加,且第14天的表达量(0.74±0.17)大于第7天(0.55±0.13)和21d(0.24±0.06)。③感染组小鼠MCP-1表达增加与NF-κB活化呈正相关(r=0.685,P<0.05)。④与对照组比较,感染组小鼠血清MCP-1含量明显增加(P<0.001),第14天达高峰(20.464±3.347),且与心肌组织中MCP-1的表达水平一致。结论:MCP-1能调节炎性细胞至受损心肌组织中,降低了心脏功能,可能在VMC发病机制中发挥了重要作用,且其表达至少部分通过NF-κB的活化来调控。     

柯萨奇病毒致小鼠心肌损害的组织形态学变化

目的:观察柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌组织的病理特点及胶原蛋白的表达情况。方法:实验于2004-10/2006-04在广西医科大学医学科学实验中心完成。①实验分组:选择80只Balb/c纯种雄性小鼠,鼠龄4￣6周,随机分为对照组20只和模型组60只。②实验方法:模型组小鼠腹腔注射柯萨奇B3Nancy株悬液0.1mL,对照组腹腔注射不含病毒的Hep-2细胞冻存液0.1mL。模型组小鼠分别于接种柯萨奇B3后第7,14,28和42天麻醉后断颈处死10只,10只,10只和9只,颈动脉采血0.8￣1.0mL,保存血清;摘取心脏,浸泡于4%多聚甲醛溶液中;对照组20只小鼠于42d后采用上述方法处死,并留取血清及心脏。③实验评估:检测血清CVB3中和抗体滴度;心肌组织切片苏木精-伊红染色后,光镜下观察组织形态学改变;免疫组化法检测心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达情况。结果:①行为学变化及死亡情况:模型组于接种后第3天出现行为学改变,第12天后症状逐渐缓解;从第4天开始发生死亡,第7￣10天为死亡高峰期,第12天后无死亡,总死亡率为35%(21/60)。②血清柯萨奇B3中和抗体滴度:模型组各时间点血清柯萨奇B3中和抗体滴度均高于对照组(P<0.01),以第7天滴度为最高。③心肌组织形态学特点:接种病毒后7d,心肌组织出现多灶性凝固性坏死,大量炎细胞浸润;28d后,坏死灶周围的炎细胞已近消失,代之以增殖的成纤维细胞。④心肌组织病理积分:模型组各时间点心肌病理积分均明显高于对照组,其中第7天增高最为显著(P<0.05)。⑤心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达:模型组各时间点心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达均明显增加,以第42天最为显著(P<0.01);第7天和第14天小鼠心肌Ⅰ/Ⅲ型胶原比值与对照组之间无显著性差别(P>0.05),而第28天和第42天则显著高于对照组(P<0.05)。结论:采用腹腔注射柯萨奇B3Nancy株悬液的方法可以成功构建病毒性心肌炎小鼠模型。病理表现为急性期心肌细胞大量坏死,伴多种炎细胞浸润,胶原蛋白表达活跃;缓解期,成纤维细胞大量增殖,胶原蛋白表达持续增高,最终导致心肌间质重构。     

同基因背景小鼠核蛋白诱导狼疮鼠模型

背景：自发性狼疮鼠模型不能对基因以外其他的致病因素进行研究。目的：以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫小鼠后诱导狼疮鼠模型。方法：选取4～6周SPF级Balb/c小鼠30只,等分为3组。V1组肌肉注射提取的同系Balb/c小鼠核蛋白,间隔3周免疫1次,共免疫4次;V2组注射等体积PBS;V3组为正常对照。检测小鼠末次免疫后3周的24h尿蛋白、血清抗核抗体、抗双链DNA抗体、小鼠肾脏直接免疫荧光。结果与结论：V1组小鼠24h尿蛋白、血清抗双链DNA抗体、抗核抗体均明显高于V2组、V3组,且V1组小鼠肾小球有免疫球蛋白G免疫复合物沉积,可见肾小球轮廓,V2组、V3组未见肾小球轮廓,只见非特异性的微弱荧光。说明以同基因背景Balb/c小鼠核蛋白免疫Balb/c小鼠能够成功诱导狼疮鼠模型。     

Liposomal gene transfer of multiple genes is more effective than gene transfer of a single gene

Liposomal gene transfer is an effective therapeutic approach for the treatment of several pathophysiologic states. The purpose of the present study was to define whether gene transfer of multiple genes is a feasible approach and whether this approach would be more effective than the single transfer of cDNA. Rats were inflicted an acute wound and divided into four groups to receive weekly subcutaneous injections of liposomes plus the Lac-Z gene (0.22 microg, vehicle), or liposomes plus the insulin like-growth factor-I (IGF-I)cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg), or liposomes plus the keratinocyte growth factor (KGF) cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg), or liposomes plus the IGF-I/KGF cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg). Planimetry, immunological assays, histological and immunohistochemical techniques were used to determine molecular mechanisms after gene transfer, protein expression, dermal and epidermal regeneration. IGF-I/KGF cDNA transfer increased IGF-I and KGF protein concentration and caused concomitant cellular responses, for example,by increasing IGFBP-3, P<0.05. IGF-I/KGF cDNA gene transfer improved epidermal regeneration by exhibiting the most rapid area and linear wound re-epithelization by almost 250% compared to control and each growth factor given individually, P<0.001, which was probably due to promitogenic and antiapoptotic effects on basal keratinocytes when compared to controls, P<0.001. Dermal regeneration was improved in IGF-I/KGF cDNA-treated animals by an increased collagen deposition and morphology when compared with vehicle, IGF-I and KGF, P<0.001. IGF-I/KGF cDNA increased VEGF concentrations and thus neovascularization when compared with vehicle, IGF-I and KGF, P<0.001. In the present study, we showed that exogenous gene transfer of multiple cDNA sequences have an additive effect on intracellular and biological responses when compared to the same gene administered as a single cDNA sequence. Our findings demonstrate that gene therapy with multiple genes is feasible, and that the gene transfer of multiple genes can enhance and accelerate physiologic and biological effects.     

基因转染新方法--声化学基因转染

目的 基因转染效率低下一直是限制基因研究与基因治疗进一步发展和广泛应用的瓶颈问题。笔者将生物技术和超声技术有机结合,提出一种基因转染新方法即声化学基因转染或声化学内在化,为提高基因转染效率提供新的思路和新手段。     

炭疽芽孢杆菌基因芯片探针的制备

目的制备炭疽芽孢杆菌(BA)基因芯片探针,应用于BA基因芯片的检测。方法采用PCR方法,以BA疫苗株A16R基因组DNA为模板,扩增pXO1质粒上的8个特异性片段,连接至pMD19-T Simple载体,构建分别包含8个探针序列的重组质粒,以其为PCR扩增模板获取探针DNA。结果基因测序证明,成功获得BA的3个探针。结论 BA基因探针的成功获取,为炭疽芽孢杆菌基因芯片的制备奠定了基础。     

Contributions of gene marking to cell and gene therapies

The first human genetic modification studies used replication-incompetent integrating vector vectors to introduce marker genes into T lymphocytes and subsequently into hematopoietic stem cells. Such studies have provided numerous insights into the biology of hematopoiesis and immune reconstitution and contributed to clinical development of gene and cell therapies. Tracking of hematopoietic reconstitution and analysis of the origin of residual malignant disease after hematopoietic transplantation has been possible via gene marking. Introduction of selectable marker genes has enabled preselection of specific T-cell populations for tumor and viral immunotherapy and reduced the threat of graft-versus-host disease, improving the survival of patients after allogeneic marrow transplantation. Marking studies in humans, murine xenografts, and large animals have helped optimize conditions for gene transfer into CD34(+) hematopoietic progenitors, contributing to the achievement of gene transfer efficiencies sufficient for clinical benefit in several serious genetic diseases such as X-linked severe combined immunodeficiency and adrenoleukodystrophy. When adverse events linked to insertional mutagenesis arose in clinical gene therapy trials for inherited immunodeficiencies, additional animal studies using gene-marking vectors have greatly increased our understanding of genotoxicity. The knowledge gained from these studies is being translated into new vector designs and clinical protocols, which we hope will continue to improve the efficiency, effectiveness and safety of these promising therapeutic approaches.     

Virus-mediated gene transfer for cutaneous gene therapy

Cutaneous gene therapy offers unique opportunities and limitations in the use of viral vectors for corrective gene transfer. Skin presents a formidable barrier to microbial invasion and is nourished by small blood vessels, thus ruling out the possibility of directed virus delivery through cannulated blood vessels. However, skin is physically accessible and its resident keratinocyte stem cell population is susceptible to direct in vivo transduction with retroviral vectors. Furthermore, keratinocyte stem cells transduced in culture have been shown to persist and to express the encoded transgene when grafted to immunocompromised mice. Cutaneous gene therapy trials are likely to involve virus-mediated transduction as a principal means of gene transfer.     

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及5类抗生素耐药相关基因检测

目的了解本地区临床分离的金黄色葡萄球菌（SA）的耐药特点,探讨SA中耐消毒剂基因（qacA）、β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯-林可霉素-链阳菌素B类（MLSB）、四环素类、糖肽类药物耐药基因的存在情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）法对20株SA进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、MLSB类基因、四环素类基因、糖肽类基因、耐消毒剂基因检测。结果 PCR结果显示20株SA中13种耐药相关基因检出率分别为mecA75%、TEM90%、aac（6＇）/aph（2″）70%、ant（4＇,4″）15%、ant（6）-Ⅰ25%、ermA100%、ermC55%、msrA20%、msrB55%、tetM65%、qacA60%,vanA、vanB基因均为阴性。结论多数SA菌株具有耐多药特征,存在耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、MLSB类、四环素类等多种抗生素耐药基因,且对胺类、胍类消毒剂耐受。