大鼠脑组织中CNTF基因克隆及其探针制备

目的　克隆大鼠CNTF基因并制备地高辛标记的CNTF探针。方法　采用RT PCR法 ,从大鼠脑组织mRNA中扩增CNTF基因ORF区片段 ,克隆入T载体 ,并经序列测定。以地高辛素标记CNTF基因片段为探针 ,对成年大鼠脊髓组织切片进行原位杂交。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 6 16bp相符 ,序列测定与CNTF基因 10 0 %同源。原位杂交显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓白质的前索及侧索的周边部分 ,为杵棒形和三角形带有纤细突起的胶质细胞。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的CNTF基因克隆 ,地高辛标记的CNTF探针原位杂交显示正常大鼠脊髓白质的部分胶质细胞中表达CNTFmRNA。     

一种原位杂交中~(35)S标记寡核苷酸DNA探针纯化的改进方法

一种原位杂交中３５Ｓ标记寡核苷酸ＤＮＡ探针纯化的改进方法应用寡核苷酸ＤＮＡ探针的原位杂交分析为分析活性基因空间分布提供了一种行之有效的方法。然而，背景和低敏感性等问题限制了它的广泛应用。比较了许多方法纯化的标记寡核苷酸ＤＮＡ探针，结果显示寡脱氧胸苷酸...     

使用Y染色体特异性探针追踪检测大鼠脑内移植细胞

目的探讨准确高效追踪检测脑内移植来源细胞的方法。方法克隆雄性大鼠Y染色体SRY基因的一个片段,并且将该片段标记成DNA探针,对大鼠的脑切片进行原位杂交。结果使用大鼠Y染色体SRY基因片段标记的探针后,可以特异性检测雌性大鼠脑内来源于雄性大鼠的移植细胞。结论使用原位杂交方法可以有效、准确地追踪检测移植细胞。     

动脉吻合术后弹性纤维的扫描电镜观察

采用甲酸消化扫描电镜观察的方法了解吻合术后动脉弹性纤维变化。Wistar大鼠 6 0只 (第三军医大学实验动物中心提供 ) ,雌雄不拘 ,体重 190±克 /只 ,0 .3%戊巴比妥钠腹腔麻醉 ,手术显微镜下 ,将大鼠一侧股动脉剪开并重新端端吻合 ,实验动物随机分成 6组 (10只 /组 ) ,模型 6组和对照组 (为各组未吻合侧动脉 )。于吻合后 3,7,14,2 1,30 ,90天 ,切取吻合侧动脉和对侧股动脉 ,经 10 %中性甲醛溶液固定 ,将动脉段纵行中间切开 ,放于 90 %甲酸中 ,45℃消化 96小时 ,液氮速冻 ,置真空蒸发器中干燥 2 4小时 ,取出真空镀金后在扫描电镜下观察吻合…     

染色体原位杂交技术发展现状

染色体原位杂交技术是建立在DNA变性、复性动力学基础上,利用核酸分子的碱基序列配对的互补性,将已知的带有标记的DNA探针与细胞标本的染色体上经变性解链后的单链DNA,通过二者特定碱基序列互补,结合成长性核酸杂交分子,经放射性、非放射性方法在染色体上显示出其位置。1970年Pardue等在细胞学标本上建立了DNA-DNA杂交方法标记着染色体原位杂交方法的产生。1974     

线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建

目的构建用于线粒体DNA（mtDNA）D-环控制区（D—LOOP区）多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D—LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N＇-对羧苄基吲哚三菁（Cy5）标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D—LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D—LOOP区片段（466bp）与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0．1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基“C”的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D—LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。     

急性甲肝病人HAV－RNA原位杂交研究

急性甲肝病人ＨＡＶ－ＲＮＡ原位杂交研究［英］／ＴａｙｌｏｒＭ…／／ＪＨｅｐａｔｏｌ．－１９９４，２０（３）．－８０～３８７寡核苷酸探针原位杂交已被用于定位ＨＡＶ－ＲＮＡ基因序列。三个病人的肝活检标本经用甲醛固定和常砚处理后再用放射性３５Ｓ标记的反义探...     

cDNA微阵列与寡核苷酸芯片的制备方法

c DNA微阵列和寡核苷酸芯片是常见的合成后点样的 DNA微阵列 ,点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上。本文总结了近年来国内外文献报道的 c DNA微阵列制备方法 :在多聚赖氨酸包被的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;用琼脂糖包被的玻璃基片制备 c DNA微阵列 ;在氨基或醛基修饰的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;寡核苷酸芯片的制备方法 :氨基修饰的玻片与 5 `末端带氨基的寡核苷酸探针通过不同的 linker连接 ;硅烷化寡核苷酸直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列 ;硫代寡核苷酸通过二硫键与巯基修饰的玻片连接 ;水凝胶芯片固定寡核苷酸 ;丙烯酰胺硅烷化的基片与 5′丙烯酰胺修饰的寡核苷酸连接。并展望了基因芯片的应用前景     

IFN—γ,IL—4,TGF—β在诱导EAMG耐受中的作用

目的为探讨鼻腔耐受和 Wistar大鼠对 EAMG耐受的机制。方法用放射标记的 c DNA寡核苷酸作探针原位杂交计数免疫后第 7周表达 IFN-γ、IL - 4和 TGF-β m RNA的 MNC。结果 EAMG大鼠 PIL N和脾脏中 IFN-γ m RNA表达细胞数比 CFA大鼠高 (P<0 .0 5 ) ;鼻腔耐受大鼠 PIL N中 IFN-γ和 IL - 4m RNA表达细胞数比 EAMG大鼠低 ,PIL N、脾脏和胸腺中 TGF-β m RNA表达细胞数比 EAMG大鼠高 (P<0 .0 5 ) ;WF大鼠 PIL N中 IFN-γ m RNA表达细胞数比 EAMG大鼠低 ,TGF- β m RNA表达细胞数比 EAMG大鼠高 (P<0 .0 5 )。结论 IFΝ- γ表达增高与 EAMG发生有关 ,IFN- γ表达降低 TGF- β表达增高与 EAMG耐受有关 ;TGF- β表达增高在 EAMG耐受中起重要作用。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型基因片段的克隆

从大鼠的尾壳核组织中提取总 RNA,以 RT-PCR方法扩增出大鼠 m Glu R5 长度约 43 5 bp的 c DNA片段。将这一片段克隆到 PGEM-T载体中进行序列分析 ,结果证实所克隆的 c DNA是编码正确的大鼠 m Glu R5 的一段基因序列。克隆的这段大鼠m Glu R5 特异性基因片段可用于制作探针 ,利用原位杂交技术检测其 m RNA在正常或异常状况下的表达 ;也可制作反意 c DNA或反意 m RNA以研究 m Glu R5 在生理或病理状态下的作用 ;还可进行反意 c DNA或反意 m RNA基因治疗。总而言之 ,克隆的这段基因 ,对研究 m Glu R5 在生理及病理条件下的功能变化 ,以及对与其有关疾病的基础研究和临床应用具有重要意义     

FISH检测乳腺癌石蜡组织切片酶消化时间的优化

荧光原位杂交(fluorescence in situ-hybridization,FISH)作为20世纪80年代末在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的非放射性原位杂交技术,通过直接或间接将荧光标记DNA特异性探针与靶细胞中同源序列的核酸杂交,实现对目的 DNA片段或基因的定量和定位分析,目前被人们普遍认为是检测Her-2基因是否活化的"金标准"。但     

大鼠脑组织中p75基因克隆及其探针制备

为了克隆大鼠p75基因并制备地高辛标记的p75 cDNA探针(dig-p75 cDNA),本研究采用RT-PCR法,从大鼠脑组织mRNA中扩增p75基因mRNA部分片段,克隆入T载体,并经序列测定。以dig-p75 cDNA为探针,采用原位杂交方法观察成年SD大鼠海马组织中p75 mRNA的表达。结果:RT-PCR法扩增出一种特异产物与预期长度386 bp相符,T载体克隆测序与p75基因100％同源。原位杂交结果显示,阳性信号出现在成年大鼠海马组织中。结论:采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织p75基因克隆,dig-p75 cDNA探针原位杂交显示正常SD大鼠海马组织中表达p75 mRNA。     

延长用于荧光原位杂交的DNA探针的使用寿命

FISH所需的整条染色体标记探针是由数千个单一序列组成的,每个单一序列都是原始序列的多个拷贝.这些探针是用DOP-PCR法扩增经纤维切割或流式分类法所获DNA.获取染色体DNA后即可进行PCR,30～40个循环,产物即为原始序列储备液.取一小份用生物素或若丹明标记即可作为FISH的标记探针,这些探针用完后可在PCR产物中再取少量重新制备探针.为避免再次做纤维切割或流式分类,可取一份这样的储备液进行再扩增,但无需标记,这样就可以获得更多的未标记DNA储备液以制备更多的探针.     

文摘

033 用PCR方法标记探针提高荧光原位杂交的效率[英]/F.Richard…//Cytogenet Cell Genec,-1994,65.-169～171 在荧光原位杂交中,获得足够的高质量DNA探针是一个很关键的因素。一般用缺口翻译法将带有生物素或地高辛的核苷酸整合到DNA中。Lemieux等用缺口翻译法标记了克隆在puc19中的一个500hp cDNA片段,然后做荧光原位杂交获得了成功,这是迄今为止报道的用荧光原位杂交法定位的最短DNA片段。实际上,大多数荧光原位杂交中用到的探针都是大的DNA     

全自动荧光原位杂交仪实验条件的优化及与手工方法的对比

<正>近年来,荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)广泛应用于分子靶向治疗、肿瘤诊断、鉴别诊断以及肿瘤预后评估方面~([1])。FISH技术通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的探针信号,以获得细胞核内染色体(或染色体片段)上基因状态的信     

足底伤害性刺激条件下大鼠腰骶髓背根节内SPmRNA和α—CGRPm…

将Ｆｏｒｍａｌｉｎ注入大鼠一侧后肢足底，分别于术后不同时间（０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８ｈ和５ｄ）将动物断头取材，用放射性同位素「α＾－３５Ｓ『ｄＡＴＰ标记的寡核苷酸探针进行原位杂交组织化学实验，检测大鼠腰髓背根节内ＳＰｍＲＮＡｔα－ＣＧＲＰｍＲＮＡ表达阳怀细胞百分率即明显增高；     

小动脉吻合后弹性纤维构筑及弹性蛋白原表达变化

目的：探讨小动脉吻合术后弹性纤维的构筑及弹性蛋白原mRNA表达的变化。方法：采用光镜、扫描电镜及寡核苷酸探针原位杂交方法，观察大鼠股动脉吻合术后3d、7d、14d、21d、30d和90d弹性纤维的构筑及弹性蛋白原mRNA表达。结果：吻合术后3d即有弹性蛋白原mRNA的表达，3～7d达到高峰，随后逐渐下降；术后14d吻合口区弹性纤维含量逐渐增多，术后30d增高明显，同时弹性纤维的形态结构趋于正常。结论：动脉吻合术后弹性纤维的重构分为：静止期、增生期、重建期。弹性蛋白原mRNA表达与弹性纤维的增生出现峰值的时间不同步。吻合后弹性纤维的重建修复为一种新生内膜型模式。     

应用SRY原位杂交技术检测肝脏干细胞移植肝内种植情况

背景：以往干细胞种植后的定植示踪技术有磁探针标记、荧光示踪标记法、慢病毒感染荧光标记法及性别交叉Y染色体原位杂交检测法,各有优缺点。 目的：应用SRY原位杂交技术观察受体来源肝脏干细胞(肝卵圆细胞)在移植肝内的定植情况。 方法：二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。供体为雌性DA大鼠,受体为雌性Lewis大鼠,设受体大鼠60只,肝卵圆细胞为Lewis大鼠来源的雄性细胞,移植中供肝种植肝卵圆细胞悬液。应用SRY原位杂交染色技术观察受体来源的雄性肝卵圆细胞在雌性移植肝内的定植情况。 结果与结论：经门静脉和肝动脉注射种植的肝卵圆细胞及其分化细胞主要定植在移植肝内中央静脉及汇管区周围,应用SRY原位杂交染色技术可以有效观察到受体来源肝脏干细胞在移植肝内的定植情况。