人脐血来源内皮祖细胞促进裸鼠皮瓣存活的实验研究

目的将内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）引入皮瓣缺血组织中，初步研究其生物学特性及在皮瓣缺血组织中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋内皮祖细胞，将体外扩增的EPC局部注射于裸鼠超长皮瓣模型中，观察EPC转归及参与皮瓣血管重建的情况；通过观察皮瓣坏死面积及微血管增生情况，评价EPC在皮瓣缺血组织中再血管化能力。结果EPC组皮瓣坏死面积明显小于空白组（P〈0．05）、真皮下层组织灌流量大于对照组（P〈0．05）；荧光示踪及免疫组织化学染色证实EPC参与皮瓣血管重建。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。     

人脐血来源内皮祖细胞的纯化鉴定及定向分化的研究

目的 检测CD133^＋血管内皮祖细胞（EPC）的细胞表面标志物，鉴定其生物学特性。方法 采用免疫磁珠法分离人脐血EPC，用EGM-2MV培养基[含表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）2等具有诱导分化作用的细胞因子]进行体外培养。应用流式细胞术、免疫组织化学等方法检测CD133^＋细胞的比例、原代EPC的生长曲线及生长特性。透射电镜查找Weibel-Palade小体。同时设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体生长及血管增生情况，以鉴定EPC的生物学特性。结果 CD133^＋细胞在免疫磁珠分离前后的比例各为0．91％及85．52％。EPC原代培养时细胞形态正常、密度均匀，前3d为相对抑制期，此后快速增殖，10d后达80％～90％融合。EPC生长曲线显示，接种后5d内细胞数量无明显变化，从第7天开始明显增加，第17天达高峰。光学显微镜下可见，原代EPC贴壁后呈梭形，接种后7d数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到，细胞膜伸出许多伪足丝，基底膜呈多层；细胞质内可见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Palade小体，确定其为EPC。裸鼠成瘤实验可见EPC组肿瘤瘕体及血管数量大于或多于对照组；抗人血管性假血友病因子（vWF）免疫荧光染色显示，大量EPC参与肿瘤血管生成。结论本实验分离培养的CD133^＋细胞具有分化为成熟血管内皮细胞的能力，即为EPC。裸鼠成瘤实验初步证明EPC参与血管重建，具有促进血管新生、加速缺血组织血管化的作用。     

含内皮祖细胞的组织工程皮肤体外构建及裸鼠移植研究

目的构建含内皮祖细胞（EPC）和成纤维细胞的组织工程复合皮，初步研究EPC在组织工程皮肤移植中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋血管内皮祖细胞，以聚羟基乙酸（PGA）为真皮基质，接种EPC和成纤维细胞，其上覆盖表皮细胞膜片，构建组织工程复合皮，覆盖裸鼠背部全层皮肤缺损创面。结果EPC和成纤维细胞能均匀贴附于PGA支架纤维材料上，并逐渐伸展为梭形或多极状。裸鼠移植实验表职，实验组创面愈合早于对照组，可见EPC参与大量新生小血管形成，真皮支架5周完全降解。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。应用PGA＋纤维蛋白凝胶，制备含EPC和成纤维细胞的活性真皮替代物，具有良好的生物相容性、降解特性。     

环氧合酶2对胰腺癌新生血管生成的调节作用及其机制

目的　探讨环氧合酶 2 (COX 2 )在胰腺癌新生血管生成中的调节作用及其作用机制。方法　应用免疫组织化学染色研究人胰腺癌组织COX 2、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)表达 ;同时标记肿瘤新生血管内皮细胞vWF和血管壁Ⅳ型胶原 ,计算肿瘤组织微血管密度 (MVD)。建立裸鼠胰腺癌细胞株PC 3移植瘤 ,观察选择性COX 2抑制剂Celebrex对肿瘤组织MVD的影响 ,并应用免疫组织化学染色和逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)研究裸鼠移植瘤组织VEGF表达变化。结果　COX 2在人胰腺癌组织中表达阳性率为 87 5 % ,VEGF阳性率为 5 8 3%。COX 2强阳性组MVD平均值显著高于COX 2弱阳性 +阴性组 ,P <0 0 1。VEGF阳性组MVD平均值高于VEGF阴性组 ,但无统计学差异 ,P >0 0 5 ;Pearson相关性检验结果表明COX 2与vWF和Ⅳ胶原标记的MVD均有明显的相关性 (相关系数分别为 0 5 99和 0 6 ) ,P <0 0 5。在裸鼠移植瘤的体内实验中 ,与对照组MVD(6 3 89± 13 6 7)相比 ,Celebrex处理组MVD为 32 2 5± 12 99,两者差异显著 ,P <0 0 1。免疫组织化学染色和RT PCR结果表明Celebrex处理组肿瘤组织VEGF表达较对照组明显下调。结论　COX 2与胰腺癌新生血管生成密切相关 ,其高表达促进了胰腺癌新生血管生成 ;可能作用机制是上调促血管生成因子VEGF     

骨髓内皮祖细胞输注后在肝纤维化大鼠肝脏内的示踪研究

目的 建立PKH26荧光标记肝纤维化大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC)的方法,观察PKH26标记的EPC输注后在肝纤维化大鼠肝内的迁移和分化情况.方法 分离和培养肝纤维化大鼠骨髓源性EPC,并在体外进行PKH26荧光标记,通过荧光共聚焦显微镜观察和采用流式细胞仪检测PKH26的标记率,并观察荧光标记对细胞生长状态的影响;将PKH26荧光标记的EPC经尾静脉输注入肝纤维化大鼠体内,观察其在大鼠肝内的迁移示踪情况,并用免疫荧光法检测内皮细胞标志物CD31和血管性假血友病因子(vWF)的表达.结果 PKH26标记的细胞呈红色荧光,标记率为96.65％;PKH26标记的EPC生长状态良好,与未标记的EPC相比,生长曲线基本一致;EPC迁移入肝后主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,并表达内皮细胞特异性抗原CD31和vWF.结论 PKH26可在体外成功标记肝纤维化大鼠骨髓源性EPC,该细胞输注入肝纤维化大鼠体内后,可迁移至肝内血管周围,并向成熟的内皮细胞分化.     

alphastatin抑制胃癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的实验研究

目的探讨alphastatin对裸鼠体内新生血管形成和人胃癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的抑制作用及机制。方法裸鼠皮下注射基质胶溶液形成基质胶体。测定alphastatin对基质胶体内新生血管的抑制作用。人胃癌BGC823细胞接种于裸鼠皮下形成移植瘤。分别于裸鼠腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）和不同剂量的alphastatin（100nmol／L,0．25mg·kg^-1·d^-1;1000nmol／L,2．5mg·kg^-1·d^-1）,测定各组瘤体大小、体质量并进行病理学分析,测定微血管密度（MVD）计数。分离瘤体内血管内皮细胞．经alphastatin处理后,提取细胞内蛋白,进行细胞鞘氨醇激酶（SPK）活性测定。结果裸鼠移植瘤实验中．与PBS对照组相比,两个不同剂量alphastatin实验组裸鼠移植瘤的体积和体质量均得到了不同程度的抑制[体积：（1145．96±29．89）μm^3、（612．65±23．45）μm^3比（1771±31．05）μm^3,P〈0．05;瘤体质量：（0．31±0．03）g、（0．12±0．02）g比（0．67±0．02）g,P〈0．05]。体外实验病理学证实．alphastatin减少了瘤体内MVD的数目．降低了移植瘤体内血管内皮细胞SPK活性．上述作用均呈现一定的量-效关系。结论alphastatin具有明显抑制人胃癌细胞裸鼠移植瘤血管生成的作用．这种效应与降低血管内皮细胞SPK活性、减少1-磷酸鞘氨醇（SIP）的生成有密切关系。     

细胞悬液接种法血管瘤裸鼠动物模型的建立

目的：探索人毛细血管瘤裸鼠移植瘤模型建立的条件。方法：将体外培养的血管瘤内皮细胞通过注射的方式植入裸鼠（BALB／c nude mice）皮下，测量不同生长时期瘤体体积变化，观察至60天后进行病理学光镜检查，并通过血管内皮细胞单克隆抗体CD31、细胞增殖标记抗体Ki-67免疫组化染色研究所成瘤体的同源性及增殖活性。结果：通过皮下植入血管瘤内皮细胞的方法成功建立了人血管瘤裸鼠动物模型，所成瘤体与原血管瘤生物学特点相似。结论：皮下植入人血管瘤内皮细胞的裸鼠动物模型建模方法可靠，能较真实地反映人血管瘤的发展过程，是研究血管瘤的较理想的平台。     

组织工程心脏瓣膜裸鼠体内移植的实验研究

目的将人血管混合细胞体外动态种植于脱细胞牛心包构建的组织工程心脏瓣膜（Tissue engineered hean valves，TEHVs）并移植入裸鼠体内，观察其生物学特征变化。方法将体外动态构建的TEHVs移植入裸鼠体内，30d时取材，观察组织、细胞的超微结构变化，种子细胞的生长行为和生物学特征变化，种子细胞与支架材料的黏附性，TEHVs的生物相容性等参数。结果组织学观察见：细胞数量、分层数较移植前增多，并有大量细胞浸润入TEHVs深层组织内：免疫组化显示：TEHVs上细胞的内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白、成纤维细胞Fibronectin相关抗原呈阳性表达；扫描电镜见：裸鼠体内移植后细胞数量较移植前增多，细胞表面和细胞之间的网状胶原结构较埋置前增多明显；透射电镜可见：W—P小体、质膜小泡、密斑、密体、微丝等特征性结构。结论TEHVs细胞能够在裸鼠体内定向分化、增殖，生物学特征无改变，TEHVs生物相容性良好。     

CXCR4信号通路介导5型磷酸二酯酶抑制剂他达拉非对内皮祖细胞的保护作用

现有的研究认为，来源于骨髓的内皮祖细胞（EPC）可通过生成内皮细胞参与体内新生血管形成。内皮祖细胞一旦释放人血液循环，将定殖于血管损伤部位，并参与血管内皮的再生与修复。     

脐带间充质干细胞分化为内皮细胞促进血管新生

目的 探讨脐带间充质干细胞能否在体内外分化为内皮细胞,参与血管新生.方法 体外实验采用内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对脐带间充质于细胞进行诱导,观察其形态变化.体内实验将脐带间充质干细胞移植到小鼠后肢缺血模型中,采用免疫组织化学鉴定细胞在体内的迁移和分化,激光多普勒血流成像仪鉴定缺血局部血流恢复情况.结果 在体外脐带间充质干细胞能够形成血管网样结构.在体内脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,表达CD31抗体,参与实验组的动物血管重建.与小鼠的血管网络发生整合,实验组的动物后肢血流灌注明显好于对照组.结论 脐带间充质干细胞能够分化为内皮细胞,参与血管新生,为治疗性血管新生提供新的细胞选择.     

骨髓血管内皮祖细胞移植提高缺血皮瓣存活率的研究

目的：探讨大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法：在Wistar大鼠背部形成2cm×8cm蒂部位于双侧髂棘连线上的随意型超比例皮瓣,建立缺血皮瓣模型。采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在专有的诱导培养基（EG-M2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;对细胞的形态、表型、功能加以鉴定。将EPCs注射移植于iWstar大鼠背部的缺血皮瓣,大体观察皮瓣的存活率,vWF免疫酶染色法检测皮瓣毛细血管密度。以缺血皮瓣单纯注射磷酸盐缓冲液（PBS）的Wistar大鼠作为对照组。结果：骨髓中分离培养的EPCs呈现典型的＂铺路石＂样外观,表达CD34、Flk-1及CDl 33表型,能够摄取DIL-ac-LDL和特异性结合FITC-UEA-1。注射EPCs组的缺血皮瓣存活率以及毛细血管密度显著高于对照组（P〈0.05）。结论：骨髓中的EPCs在体外培养后注射移植于皮瓣内,可以促进缺血性皮瓣的血管新生,提高缺血性皮瓣的存活率。     

Diabetic wound healing in a MMP9‐/‐ mouse model

Reduced mobilization of endothelial progenitor cells (EPCs) from the bone marrow (BM) and impaired EPC recruitment into the wound represent a fundamental deficiency in the chronic ulcers. However, mechanistic understanding of the role of BM‐derived EPCs in cutaneous wound neovascularization and healing remains incomplete, which impedes development of EPC‐based wound healing therapies. The objective of this study was to determine the role of EPCs in wound neovascularization and healing both under normal conditions and using single deficiency (EPC) or double‐deficiency (EPC + diabetes) models of wound healing. MMP9 knockout (MMP9 KO) mouse model was utilized, where impaired EPC mobilization can be rescued by stem cell factor (SCF). The hypotheses were: (1) MMP9 KO mice exhibit impaired wound neovascularization and healing, which are further exacerbated with diabetes; (2) these impairments can be rescued by SCF administration. Full‐thickness excisional wounds with silicone splints to minimize contraction were created on MMP9 KO mice with/without streptozotocin‐induced diabetes in the presence or absence of tail‐vein injected SCF. Wound morphology, vascularization, inflammation, and EPC mobilization and recruitment were quantified at day 7 postwounding. Results demonstrate no difference in wound closure and granulation tissue area between any groups. MMP9 deficiency significantly impairs wound neovascularization, increases inflammation, decreases collagen deposition, and decreases peripheral blood EPC (pb‐EPC) counts when compared with wild‐type (WT). Diabetes further increases inflammation, but does not cause further impairment in vascularization, as compared with MMP9 KO group. SCF improves neovascularization and increases EPCs to WT levels (both nondiabetic and diabetic MMP9 KO groups), while exacerbating inflammation in all groups. SCF rescues EPC‐deficiency and impaired wound neovascularization in both diabetic and nondiabetic MMP9 KO mice. Overall, the results demonstrate that BM‐derived EPCs play a significant role during wound neovascularization and that the SCF‐based therapy with controlled inflammation could be a viable approach to enhance healing in chronic diabetic wounds.     

Co‐Transplantation of Bone Marrow‐Derived Endothelial Progenitor Cells Improves Revascularization and Organization in Islet Grafts

Bone marrow‐derived early endothelial progenitor cells (BM‐EPCs) are a clinical tool for enhancing revascularization. However, the therapeutic efficacy of co‐transplantation of BM‐EPC with islets has not been investigated. In this study, marginal mass islets were co‐transplanted with or without BM‐EPCs under the kidney capsules of syngeneic streptozotocin‐induced diabetic mice. Using green fluorescent protein transgenic (GFP‐Tg) mice as BM‐EPC and islet donors or recipients, the role of EPCs in revascularization was assessed for graft morphology, vascular density and fate of EPCs by immunohistochemistry. Islet‐EPC co‐transplantation improved the outcome of islet transplantation as measured by glucose tolerance, serum insulin level and diabetes reversal rate, compared with transplantation of islets alone. Between groups, the morphology of islet grafts showed significant differences in size and composition of grafted endocrine tissues. Significantly more vessel density derived from donors and recipients was detected with islet‐EPC co‐transplantation. Abundant GFP‐Tg mice‐derived BM‐EPCs (GFP‐EPCs) were observed in or around islet grafts and incorporated into CD31‐positive capillaries. Remaining GFP‐EPCs expressed VEGF. In conclusion, co‐transplantation of islets with BM‐EPCs could improve the outcome of marginal mass islet transplantation by promoting revascularization and preserving islet morphology.     

Erythropoietin improves the efficiency of endothelial progenitor cell therapy after myocardial infarction in mice: effects on transplanted cell survival and autologous endothelial progenitor cell mobilization

BackgroundEndothelial progenitor cells (EPCs) participate in vascular repair and angiogenesis. Thus, EPC transplantation into ischemic myocardium might improve cardiac function; however, the vast majority of cells die within a short period. The present study was designed to investigate whether exogenous erythropoietin (EPO) delivery could improve the survival of transplanted EPCs and enhance the efficiency of EPC-based cell therapy.MethodsMyocardial infarction was induced in wild-type mice by ligating the left anterior descending coronary artery. Enhanced green fluorescent protein-EPCs with or without EPO were transplanted into peri-infarct myocardium. Enhanced green fluorescent protein-EPCs were detected 7 and 28 d after surgery. The amount of circulating EPCs was analyzed 3 and 28 d after surgery. The stromal cell-derived factor-1α and vascular endothelial growth factor concentrations, microvessel density, apoptosis, fibrosis in the peri-infarct myocardium, and cardiac function were compared among the groups.ResultsMore enhanced green fluorescent protein-EPCs were found in the hearts treated with EPC + EPO than in those treated with EPC alone. The circulating EPC level was markedly elevated after EPC + EPO treatment compared with EPC application alone. Stromal cell-derived factor-1α and vascular endothelial growth factor were increased accordingly, along with increased microvessel density, decreased apoptosis, and reduced fibrosis in the peri-infarct myocardium. Left ventricular fractional shortening was greater and the interventricular septum was thicker after EPC + EPO treatment compared with EPC treatment alone.ConclusionsEPO improved the efficiency of EPC therapy in mice with myocardial infarction. This effect was associated with enhanced transplanted EPC survival and autologous EPC mobilization.     

局部注射内皮祖细胞改善糖尿病大鼠后肢血管病变

目的探讨局部注射同种异体内皮祖细胞(EPCs)对糖尿病大鼠后肢血管病变的作用,并探讨其可能机制。方法腹腔注射链佐星制备SD大鼠糖尿病模型,然后将其两后肢股动脉结扎,制成血管病变模型。将模型分为两组,移植组大鼠左后肢为实验侧,自结扎部位以下每0.5 cm注射分离自糖尿病大鼠外周血的以荧光染料标记的EPCs悬液0.5 ml(含EPCs 2.5×105个),右后肢为对照侧,注射等量的磷酸盐缓冲液;空白对照组不注射任何溶液。注射EPCs后1周,采用酶联免疫吸附试验检测后肢局部肌肉组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达;注射EPCs后28 d,切取局部肌肉组织,荧光显微镜下观察组织切片中荧光染料的染色情况,免疫组织化学法检测von Willebrand因子(vWF)表达情况,并计算毛细血管密度。结果注射EPCs后1周,移植组实验侧组织中VEGF含量高于对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和对照侧的差异无统计学意义(P>0.05)。注射EPCs后28 d,荧光显微镜下可见注射部位组织中蓝染的毛细血管内皮细胞;注射EPCs的左后肢局部毛细血管密度高于未注射的对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P< 0.05)。结论同种异体EPCs注射至糖尿病大鼠缺血后肢能分化为毛细血管内皮细胞,从而改善局部供血,局部VEGF分泌增加可能参与这一过程。     

人脐血CD133+血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

目的探讨从人脐血中分离、体外培养CD133^＋血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及其生长特性和鉴定。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133^＋细胞,进行流式细胞仪检测纯度,予EBM-2培养液接种培养,观察其生长特性;利用Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测CD133^＋细胞平均占单核细胞的（1．13±0．10）％,磁珠分选所得CD133^＋细胞平均纯度为（91．45±1．04）％;CD133^＋细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落;CD133^＋细胞培养过程中Dil-LDL及FITC-Lectin摄取阳性,双染阳性率为（95．83±1．72）％;CD133^＋细胞培养1周后经免疫组织化学检测CD34、Ⅷ因子阳性率分别为（95．83±2．23）％和（95．92±1．43）％,与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义;CD133^＋细胞体外培养4d、1周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度CD133^＋血管内皮祖细胞,在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。