皮质酮对TNF—α致海马神经元细胞内钙变化的作用

应用荧光影像系统检测了原代培养海马神经元内钙离子的变化情况，并分析了皮质酮、肿瘤坏死因子（TNF－α）对谷氨酸引起的海马神经元内钙升高的调节作用及其皮质酮对TNF－α作用的调节。结果显示：（1）使用不同浓度的皮质酮处理海马神经元48h后，观察到10^-6mol/L和10^-7mol／L的皮质酮可诱导海马神经元静息钙浓度升高，但10^-8mol/L和10^-9mol/L的皮质酮对海马神经元内钙无影响。（2）10^-6mol/L皮质酮处理海马神经元48h后，对谷氨酸诱导的海马神经元内钙升高无调节作用。（3）使用100ngTNF－α处理海马神经元48h后，既可诱导海马神经元静息钙升高，也可抑制谷氨酸引起的海马神经元内钙升高。（4）皮质酮可逆转TNF－α对海马神经元静息钙浓度的调节作用，但对TNF－α抑制谷氨酸升钙效应无影响。     

姜黄素对AMPA/KA受体介导大鼠海马神经元钙内流的影响

目的 探讨姜黄素对α-氨基-3-羧基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(AMPA)/海人酸(KA)受体介导大鼠海马神经元钙内流的影响.方法 选用胚胎17dSD鼠分离海马,离体培养海马神经元,借助活体钙荧光染色和激光共聚焦钙成像技术观察100μmol/LKA刺激海马神经元内钙的变化,不同浓度(5、10、15、30、50 μmol/L)姜黄素预孵育海马神经元30min对100μmol/L KA刺激下细胞内钙变化的影响,15 μmol/L姜黄素对不同浓度(10、30、50、100、200、300 μmol/L)KA刺激海马神经元内钙变化的影响.应用钴染色技术观察(30、100 μmol/L KA)刺激后海马神经元钴阳性染色细胞变化.姜黄素预孵育30min对KA刺激导致钴阳性染色细胞变化的影响.结果 不同浓度姜黄素预孵育30 min均可以明显缓解100 μmol/L或30 μmol/L KA导致的细胞内钙升高程度.差异均有统计学意义(P<0.05),其中15 μmol/L姜黄素作用最为明显.30μmol/L或100 μmol/LKA刺激均可以引起海马神经元钴染色阳性细胞增加,15 μmol/L姜黄素预处理30 min后明显减少钴染色阳性细胞,差异有统计学意义(P<0.05),而其他浓度(5 μmol/L或30 μmol/L)姜黄素未见明显影响.结论 一定浓度的姜黄素可以影响AMPA/KA受体介导大鼠海马神经元钙内流.这可能是姜黄素抗癫痫作用的一个机制.     

Mg2+快速抑制谷氨酸诱导大鼠海马神经元内游离钙浓度升高的作用及特征

目的　采用钙离子特异性荧光指示剂Fura 2 /AM ,使用光电联合检测系统检测镁离子 (Mg2 + )对谷氨酸培养的海马神经元内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)的影响和特征。方法　实验设计分三组 (n =2 6 ) ,向细胞吹药各 2 0秒 :①组 1× 10 -5mol/L谷氨酸 ;②组同时 1× 10 -5mol/L谷氨酸和 1× 10 -5mol/LMg2 + ;③组即在②组回到基线后给 1× 10 -5mol/L谷氨酸。结果　①组 [Ca2 + ]i 明显升高 ;②组 [Ca2 + ]I 的变化明显变小 ,其峰值明显下降 ,且Phase 1上升速度减慢 ,Phase 2的时间也有所缩短 ,二相之间的平台期相对延长 ;③组出现与①组中相似的钙震荡表现 ,但Phase 1和Phase 2的时间均缩短 ,△ [Ca2 + ]i 的变化稍低。结论　Mg2 + 可快速抑制谷氨酸诱导大鼠海马神经元内游离钙浓度升高。     

皮质酮对大鼠背根神经节细胞钙电流的快速抑制作用

探讨了皮质酮(Corticosterone)对急性分离的大鼠背根神经节细胞(DRG神经元)上电压依赖性钙通道电流的快速作用及作用机制.实验采用全细胞膜片钳方法,结果显示三种浓度的皮质酮,10-7mol/L,10-9mol/L,10-12mol/L均可以在3～5 s的时间内,快速抑制DRG神经元上的电压敏感钙通道电流,其平均抑制的程度分别为48%,37%和25%.且这种快速抑制作用在吹药15 s后可以达到最大,停药20 s后钙电流基本恢复为原来的大小.在外液中加入500 nmol/L的PKC抑制剂BIS之后,皮质酮的对钙电流的快速抑制作用被阻断,提示这一作用可能与PKC信号转导途径有关.     

神经生长因子对糖皮质激素诱导大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的探讨神经生长因子对糖皮质激素诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法体外分离原代培养18只新生Wister大鼠海马神经元,噻唑蓝法测定地塞米松诱导海马神经元凋亡的最低敏感剂量,观察不同质量浓度神经生长因子对地塞米松(0.10×10~(-6)mol/L)诱导海马神经元凋亡的保护作用。结果与阴性对照组相比,地塞米松Ⅰ组(10×10~(-6)mol/L)、Ⅱ组(1×10~(-6)mol/L)和Ⅲ组(0.10×10~(-6)mol/L)大鼠海马神经元活性均降低(P=0.000,0.000,0.000)。予不同质量浓度神经生长因子后,神经生长因子0.18 ng/ml组大鼠海马神经元活性低于阴性对照组(P=0.000)和阳性对照组(P=0.010),神经生长因子18 ng/ml组大鼠海马神经元活性高于阳性对照组(P=0.000)和神经生长因子0.18 ng/ml组(P=0.000)。结论糖皮质激素可以诱导体外培养的大鼠海马神经元凋亡,地塞米松0.10×10~(-6)mol/L是诱导海马神经元凋亡的最低敏感剂量,神经生长因子可以拮抗地塞米松诱导的大鼠海马神经元凋亡。     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

海马神经元兴奋性毒性模型的建立及其意义

目的探讨不同浓度谷氨酸对海马神经元的损伤作用,流式细胞仪在建立理想的兴奋性毒性模型中的应用。方法在体外原代培养10d的海马神经元中分别加入不同浓度的谷氨酸(100、200、400、600、800μmol/L),24h后相差显微镜下观察细胞形态变化,用MTT法检测存活率和流式细胞仪检测凋亡率以评定谷氨酸对海马神经元的损伤程度。结果不同浓度的谷氨酸组与对照组的细胞存活率差异有显著性(P<0.01),并呈浓度依赖性,随着谷氨酸浓度的升高,神经元的存活率降低;谷氨酸终浓度(100、200、400μmol/L)组的细胞凋亡率与对照组比较差异有显著性(P<0.01);600和800μmol/L谷氨酸组的细胞凋亡率与对照组比较差异无显著性(P>0.05),但细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的增加而降低。结论过高浓度的谷氨酸导致细胞急性坏死而非迟发性凋亡,运用流式细胞仪检测体外培养海马神经元凋亡率是一种特异性高的检测方法,值得推广。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽减轻一氧化氮介导的谷氨酸神经毒作用

研究垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是否通过作用于一氧化氮(NO)代谢途径,减轻谷氨酸的神经毒作用.取新生SD大鼠海马,用B27无血清培养基培养神经元;重氮化反应法测定NO浓度,MTT法测定神经元存活率,PACAP能减少谷氨酸引起的海马神经元死亡;谷氨酸呈剂量依赖性地增加海马神经元培养液中NO的含量,PACAP能不同程度地减少NO的含量;分别给予2 mmol/L L-Arg,100 靘ol/L SNP和 200 靘ol/L SNAP处理后,海马神经元存活率明显下降,给予不同浓度的PACAP (10-9,10－11,10-13 mol/L)能增加神经元的存活率.上述结果提示,PACAP通过抑制NO释放及其神经毒作用,减轻谷氨酸引起的海马神经元损害.     

α-细辛醚对无镁细胞外液培养海马神经元构建难治性癫痫细胞模型的影响**★

背景：无镁细胞外液处理培养的海马神经元可诱导产生反复自发性癫痫样放电，该模型可作为临床难治性癫痫细胞模型。 目的：探讨难治性癫痫细胞模型中α-细辛醚对神经元的保护作用。 方法：分离培养新生24 h内的SD大鼠海马神经元，取经鉴定的海马神经元，加入含终浓度为7.5，15，30，60，120 mg/L α-细辛醚的维持培养液培养4 h后，换为无镁液建立难治性癫痫细胞模型，3 h后恢复含α-细辛醚的维持培养基继续培养24 h，MTT法检测海马神经元活力。 结果与结论：经无镁细胞外液培养后，海马神经元的活力显著降低(P < 0.01)，α-细辛醚处理后，海马神经元的活力显著升高(P < 0.01)，且随α-细辛醚浓度的增加，海马神经元的相对活力升高。说明α-细辛醚可以抑制难治性癫痫细胞模型中的神经元损伤，发挥神经元保护作用，且具有剂量依赖性。     

N-乙酰半胱氨酸抗谷氨酸诱导海马神经元损伤的研究

目的　观察N-乙酰半胱氨酸(N- acetylcysteine,NAC)对不同浓度谷氨酸(Glutamte,Glu)诱导海马神经元损伤的影响,探讨其作用机制,评价毒性作用。方法　采用台盼蓝活细胞拒染与TUNEL法比较不同浓度NAC预处理3d给药与细胞毒性暴露后快速给药对10 0μmol/ L、5 0 0μm ol/ L Glu诱导体外培养海马神经元损伤的影响,并与MK- 80 1比较;利用激光扫描共聚焦显微镜(L SCM)观测细胞内Ca2 浓度变化;采用台盼蓝活细胞拒染、原子力显微镜(AFM)及细胞内酯酶活性判定方法评价NAC毒性。结果　NAC可降低10 0μmol/ L Glu诱导的海马神经元死亡率,以预处理组为佳,1m mol/ L NAC预处理保护效果类似于10μmol/ L MK - 80 1;NAC对5 0 0μm ol/ L Glu诱导的海马神经元损伤无保护作用。1mm ol/ L NAC预处理抑制Glu诱导的神经元Ca2 内流。经10 0 mmol/ L NAC作用的细胞虽然形态完整,但台盼蓝染色蓝染,失去对Glu毒性的反应性;AFM扫描见神经元细胞膜皱缩;培养基Ca2 经Fluo- 3(AM)标记后L SCM下无激发荧光。结论　NAC对轻度Glu细胞毒性损伤有保护作用,预防性用药效果更优越。认为抑制Glu诱导的神经元Ca2 内流为其保护机制之一。高浓度NAC具有固定作用     

凝血酶对原代培养海马神经元游离钙浓度的影响

目的研究原代培养的海马神经元内游离Ca2 水平及凝血酶的影响.方法大鼠海马神经元进行体外原代培养,用钙离子指示剂Fura-2双波长法测定海马神经元内游离[Ca2 ]i及不同浓度的凝血酶作用后细胞内[Ca2 ]i.结果原代培养的海马神经元生长旺盛,密度高,符合实验要求.在胞外Ca2 浓度为0.0 mmol/L时,静息状态下海马神经元游离[Ca2 ]i为(79.83±18.78)nmol/L.当胞外Ca2 浓度为1.3 mmol/L时,海马神经元游离[Ca2 ]i为(106.41±22.53)nmo1/L.(1～40)U/ml凝血酶可使海马神经元内游离Ca2 水平显著升高,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.01).随凝血酶浓度的增加,胞内游离[Ca2 ]i之呈剂量依赖性增加.结论凝血酶可使原代培养的海马神经元内游离Ca2 浓度明显升高.     

皮质酮对大鼠背根神经节细胞钙电流的快速抑制作用

探讨了皮质酮 (Corticosterone)对急性分离的大鼠背根神经节细胞 (DRG神经元 )上电压依赖性钙通道电流的快速作用及作用机制。实验采用全细胞膜片钳方法 ,结果显示三种浓度的皮质酮 ,10 7mol/L ,10 9mol/L ,10 12 mol/L均可以在 3～ 5s的时间内 ,快速抑制DRG神经元上的电压敏感钙通道电流 ,其平均抑制的程度分别为4 8% ,37%和 2 5 %。且这种快速抑制作用在吹药 15s后可以达到最大 ,停药 2 0s后钙电流基本恢复为原来的大小。在外液中加入 5 0 0nmol/L的PKC抑制剂BIS之后 ,皮质酮的对钙电流的快速抑制作用被阻断 ,提示这一作用可能与PKC信号转导途径有关。     

阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用。方法选用出生0~24hSprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养10d后用于实验。将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ1-42组:加入1.25μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5μmol/L)。应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达。Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变。结果与正常对照组比较,培养10d海马神经元经1.25μmol/L Aβ1-42作用48h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P0.01),而0.5、1.0、2.5μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P0.01)。免疫荧光及Western blot结果显示,1.25μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低。结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关。     

美满霉素对脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的探讨美满霉素(MC)对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法采用相应浓度的MC或LPS(100 ng/ml)对MC组及0.1、1、10、100μmol/L MC+LPS组、LPS组、空白对照组BV-2小胶质细胞进行预处理。ELISA法检测BV-2小胶质细胞TNF-α蛋白的表达,逆转录-PCR检测细胞TNF-αmRNA表达。结果与空白对照组比较,0.1、1μmol/L MC+LPS组及LPS组的TNF-α水平显著升高(均P0.01)。10、100μmol/L MC+LPS组TNF-α水平显著低于LPS组(均P0.01)。与空白对照组比较,LPS组及10μmol/L MC+LPS组TNF-αmRNA的表达水平显著增高(均P0.01)。10μmol/L MC+LPS组TNF-αmRNA表达水平显著低于LPS组(P0.01)。结论 MC预处理(≥10μmol/L)可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞TNF-α的表达。     

β-淀粉样蛋白对海马神经元钙离子浓度的影响及其机制研究

目的　观察β-淀粉样蛋白 (Aβ1 -40 )对海马神经元内钙离子浓度的影响及尼莫地平的拮抗作用。方法　采用大鼠海马神经元的原代培养技术 ,分别用 MTT法和激光扫描共聚焦显微镜结合 Fluo-3 /AM标记观察神经元存活率和细胞内游离钙离子浓度变化。结果　 Aβ1 -40在较高浓度 (1μmol/L和 1 0μmol/L )下 ,对神经元存活率和 [Ca2 + ]i 的影响与对照组相比 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;5 μmol/L尼莫地平可部分降低Aβ1 -40引起的 [Ca2 + ]i 升高。结论　 Aβ1 -40可引起培养海马神经元存活率下降及胞内钙离子浓度升高 ,尼莫地平有部分拮抗作用。     

骨形态发生蛋白4在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

目的探讨骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)在β淀粉蛋白(amyloidβ,Aβ)诱导的神经毒性病变中的变化。方法 SD大鼠海马神经元原代培养,经过不同浓度(10、15、20μmol/L)Aβ25-35毒性片段处理后,通过定量PCR技术检测BMP4mRNA表达水平。SD大鼠双侧基底前脑注射Aβ1-40建立大鼠痴呆模型,通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区BMP4蛋白表达水平。结果 Aβ25-35处理组海马神经元内BMP4mRNA表达较空白对照组明显减少(P0.05)。免疫组化和免疫印迹实验结果显示,与对照组比较,Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区BMP4蛋白表达减少,海马区其表达升高(P0.05)。结论 Aβ直接下调神经元内BMP4转录及表达,不同脑区内BMP4蛋白可能存在负反馈调节作用。     

慢性癫癎模型海马神经元内钙稳态和钙动力学的长期变化

目的 探讨海马神经元内长期钙离子([Ca2+]i)和动力学变化在癫疴发生机制中的作用.方法 建立氯化锂-匹罗卡品慢性癫癎模型,于致痫后6 h和1、3、7、14、30 d不同时间点应用激光共聚焦显微镜观察离体海马神经元内[Ca2+]i的变化以及谷氨酸负荷后神经元内[Ca2+]i恢复速度的变化.结果 正常对照组大鼠急性分离海马神经元[Ca2+]i为(95.4±22.1)nmol/L,致癎后急剧升高至(867.6±35.2)nmol/L,第7天降低(292.8±18.3)mnol/L,此后持续在此水平,30 d后降至(220.8±17.6)nmol/L,仍高于对照组(t=12.55,P<0.01);正常对照组大鼠92%的海马神经元内[Ca2+]i处于正常范围内(25～150 nmol/L),致癎后6 h,所有神经元[Ca2+]i均有升高,并且85%的神经元高于500 nmol/L,致癎7、14、30 d后分别有75%、60%、52%的神经元[Ca2+]i高于正常值,但高于500 nmol/L者逐渐减少;经接触5 μmol/L谷氨酸人工脑脊液2 min后,对照组神经元可在(9.5±3.4)min内恢复至基线水平,而急性期、潜伏期、慢性期的癫癎神经元均存在明显延迟(t=5.08、4.56、4.21,P<0.01).结论 氯化锂-匹罗卡品致疴后可造成海马神经元内长期的[Ca2+]i和钙动力学改变,该种长期可塑性改变在慢性癫癎模型的诱发和维持中起着重要作用.     

4000/姜黄素对TNF - α诱导大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制

目的：观察姜黄素对TNF-α诱导的大鼠海马神经元损伤的结构性保护作用并研究其机制。方法：大鼠海马神经元原代培养至第5天,神经元被分为四组。每组分别加药后,马上在倒置显微镜下对神经元进行动态拍照1小时并在加药后48小时进行静态拍照以观察神经元的形态改变。另外一批神经元被原代培养至第7天,也被分为四组,然后加入药物。马上在激光共聚焦显微镜下观察神经元荧光标记的Ca2+浓度变化。结果：药物处理后1小时和48小时,对照组、姜黄素组和姜黄素加TNF-α组神经元的形态是正常的。但加药后1小时,TNF-α组神经元胞体肿胀,树突及次级分支逐渐萎缩并最终消失。加药后48小时,TNF-α组神经元生长稀疏,胞体小,几乎没有轴突和次级分支从胞体伸出,不能形成网状结构。激光共聚焦扫描提示TNF-α诱导Ca2+快速内流入胞浆。姜黄素可以部分拮抗TNF-α诱导的Ca2+浓度增加。TNF-α组和姜黄素加TNF-α组Ca2+荧光强度较基础荧光强度分别增加53.40±1.58和25.36±0.76。两组差别有统计学意义。结论：姜黄素对大鼠海马神经元有结构性保护作用,其机制是姜黄素可以阻止TNF-α诱导的Ca2+快速内流,通过NMDA受体维持神经元胞浆的Ca2+平衡。     

神经肽Y对海马神经元“癫痫样”动作电位的影响

目的探讨神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)对海马神经元"癫痫样"动作电位的影响。方法用无镁细胞外液处理原代培养12 d的海马神经元3 h,诱导海马神经元癫痫样放电,建立海马神经元癫痫样放电模型;用全细胞膜片钳电流钳模式检测神经元动作电位,分别给予0.1μmol/L和1μmol/L NPY各1μL,给药时间10 s,观察其对神经元动作电位频率及波幅的影响。结果无镁细胞外液处理神经元3 h,可以形成稳定的海马神经元癫痫样放电模型,频率16～23 Hz,波幅75～96 mV。模型组神经元动作电位频率为(18.00±2.32)Hz,而0.1μmol/L和1μmol/L NPY组分别为(4.75±1.04)Hz和(1.50±0.75)Hz。与模型组相比较,两种浓度NPY组均降低了动作电位发放的频率(P<0.05)。模型组神经元动作电位波幅为(82.25±5.17)mV,而0.1μmol/L和1μmol/L NPY组分别为(49.75±2.49)mV和(40.00±2.20)mV。与模型组相比较,两种浓度NPY组均降低了动作电位发放的波幅(P<0.05)。两种浓度NPY之间相比较,也有统计学差异(P<0.05)。1μmol/LNPY明显抑制了动作电位发放的频率和波幅。结论 NPY能够抑制无镁细胞外液诱发的神经元癫痫样电活动,为应用NPY抑制癫痫发作提供了细胞电生理学证据。