Effects of betulinic acid on proliferation and apoptosis in Jurkat cells and its in vitro mechanism

Summary  The anti-cancer effects of betulinic acid (BA) on Jurkat cells and its in vitro mechanism were examined by using MTT assay. Apoptosis was detected by using Hoechst33258 staining and annexin-V/PI double-labeled cytometry. The effects of betulinic acid on the cell cycle of Jurkat cells were studied by propidium iodide method. RT-PCR and Western blotting were used to analyze the changes of cyclin D3, bcl-xl mRNA and protein levels in Jurkat cells after treatment with betulinic acid. Our results showed the proliferation of Jurkat cells was decreased in betulinic acid-treated group with a 24-h IC50 value being 70.00 μmol/L. Betulinic acid induced apoptosis of Jurkat cells in a time- and dose-dependent manner. The number of Jurkat cells treated with betulinic acid showed an increase in G₀/G₁ phase and decrease in S phase. After treatment with 0, 20, 60, 100 μmol/L betulinic acid for 24 h, the number of Jurkat cells was increased from (31.00±1.25)% to (58.84±0.32)% in G₀/G₁ phase, whereas it was decreased from (61.45±1.04)% to (35.82±1.95)% in S phase. PBMCs were less sensitive to the cytotoxicity of betulinic acid than Jurkat cells. The expressions of cyclin D3, bcl-xl mRNA and protein were decreased sharply in Jurkat cells treated with betulinic acid. It is concluded that betulinic acid is able to inhibit the proliferation of Jurkat cells by regulating the cell cycle, arrest cells at G₀/G₁ phase and induce the cell apoptosis. The anti-tumor effects of betulinic acid are related to the down-regulated expression of cyclin D3 and bcl-xl. Zi CHEN, Female, born in 1980, Resident This project was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30500686).     

白桦脂酸联合沙利度胺诱导U266细胞凋亡机制研究

目的：探讨白桦脂酸联合沙利度胺诱导多发性骨髓瘤（ MM）U266细胞凋亡的机制。方法：分别用白桦脂酸（20、40、60和80 mg/L,白桦脂酸组）、沙利度胺（10、50和100 mg/L,沙利度胺组）及白桦脂酸（40 mg/L）联合沙利度胺（联合组,白桦脂酸40 mg/L,沙利度胺10、50和100 mg/L）分别处理U266细胞,同期设对照组;MTT法和流式细胞术分别检测不同浓度白桦脂酸组、沙利度胺组及联合组U266细胞增殖抑制率和凋亡率;Real-time PCR检测4组U266细胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA的表达,蛋白免疫印迹法检测4组U266细胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果：随着白桦脂酸浓度的增加,U266细胞增殖抑制率增加,差异有统计学意义（ P＜0.05）,最适浓度为40 mg/L;与沙利度胺组相比,联合组U266细胞的增殖抑制率和凋亡率明显升高,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;与沙利度胺组或白桦脂酸组相比,联合组 U266细胞中Survivin、Bcl-2 mRNA的表达明显降低,Cyto-C和Bax mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;与沙利度胺、白桦脂酸组相比,联合组U266细胞中Survivin、Bcl-2蛋白表达明显降低,Cyto-C和Bax蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义（ P＜0.05）。结论：白桦脂酸联合沙利度胺可以促进多发性骨髓瘤U266细胞凋亡,其机制可能与凋亡分子Survivin、Bcl-2、Cyto-c和Bax相关。     

新藤黄酸体外抑制肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的研究新藤黄酸（Gambogenic acid,GNA）抑制肺腺癌细胞株A549增殖的作用及其相关机制。方法不同浓度GNA分别作用A549细胞24、48和72 h,甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测药物对A549细胞增殖的抑制率,吖啶橙/溴化乙啶（acridine orange/ethidium bromide,AO/EB）染色荧光显微镜检测细胞的凋亡;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）法检测GNA对A549细胞损伤作用。结果 MTT法检测结果显示,GNA在0-8μmol/L浓度范围内、24-72 h时间范围内对A549的生长有明显抑制作用,且呈浓度和时间依赖关系;相差显微镜观察表明GNA作用A549细胞48 h后,细胞变圆,呈半贴壁状态;AO/EB染色荧光显微镜观察显示GNA作用48 h后,细胞出现典型的凋亡特征;LDH实验进一步证实GNA在0-4μmol/L浓度范围内对正常细胞未见明显毒性作用。与空白对照组比较,8μmol/L GNA显著降低LDH释放。结论 GNA具有体外抑制肺腺癌细胞株A549增殖的作用,在0-4μmol/L浓度范围内GNA可能是通过诱导细胞凋亡而发挥抑制A549细胞增殖的作用。     

齐墩果酸诱导Jurkat细胞凋亡及对ROS和细胞内Ca2+含量的影响

目的 探讨齐墩果酸对白血病Jurkat细胞株增殖抑制和诱导凋亡作用,分析凋亡发生与细胞内活性氧(ROS)及钙离子浓度([Ca2+]i)变化的关系.方法 应用MTT法检测细胞增殖抑制;流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期;DCFH-DA荧光定量法检测ROS含量;Fluo-3AM荧光负载方法测定[Ca2+]i的变化.结果 齐墩果酸对Jurkat细胞的增殖具有浓度依赖性和时间依赖性抑制作用,0,40,80,160 μmol/L齐墩果酸作用24 h细胞凋亡率分别为(7.36±0.40)％、(19.80±1.59)％、(29.39±0.64)％、(34.72±0.94)％,G0/G1期细胞比例分别为(54.26±1.43)％、(85.83±0.91)％、(91.18±1.32)％、(92.90±1.19)％.80 μmol/L和160μmol/L齐墩果酸处理24 h,细胞中ROS和[Ca2+]i水平均明显高于对照组(P＜0.05),ROS和[Ca2+]i水平均与细胞凋亡率呈正相关(r分别为0.95、0.97).结论 细胞中ROS和Ca2+可能参与了齐墩果酸对Jurkat细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用.     

苯并咪唑衍生物BMT-1对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨苯并咪唑衍生物BMT-1对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用CCK-8测定BMT-1对Jurkat细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测BMT-1对Jurkat细胞的细胞周期、细胞凋亡和线粒体膜电位的影响.结果 BMT-1可显著抑制Jurkat细胞增殖,呈剂量依赖效应,GI50为1.08 μmol/L.BMT-1可诱导Jurkat细胞SubG1峰显著增强、凋亡细胞比例显著增加和线粒体膜电位显著改变.结论 苯并咪唑衍生物BMT-1能显著抑制Jurkat细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

IL-21对Jurkat细胞增殖及WAVE-1表达的影响

目的探讨白介素-21（IL-21）对Jurkat细胞增殖的抑制作用及WASP家族Verprolin同源蛋白-1（WAVE-1）在急性白血病（AL）发病中可能的作用及意义。方法以不同浓度IL-21处理Jurkat细胞;通过MTT（噻唑兰比色法）检测观察IL-21对Jurkat细胞生长的影响;流式细胞仪观察24h后IL-21对细胞凋亡的影响;采用RT—PCR检测WAVE-1的表达。结果IL-21能明显抑制Jurkat细胞增殖,抑制作用呈剂量时间依赖效应（P〈0．05）;IL-21作用24h后,细胞凋亡随药物浓度增高而增加（P〈0．05）;WAVE-1 mRNA表达水平随IL-21处理浓度的增高而降低（P〈0．05）。结论IL-21可以抑制人急性白血病细胞的生长和诱导其凋亡,其机制可能与降低WAVE-1的表达有关。     

氨茶碱对K562细胞增殖与凋亡的影响

目的 为探讨磷酸二酯酶抑制剂在慢性粒细胞白血病细胞系增殖与凋亡中的作用,研究了非选择性磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱对K562细胞系的影响.方法 采用MTT检测观察细胞增殖变化,膜联蛋白V染色观察细胞凋亡率.结果 MTT显示氨茶碱对K562细胞系增殖呈浓度依赖性抑制作用,膜联蛋白V染色显示氨茶碱诱导细胞凋亡率增加.结论 氨茶碱可诱导K562细胞凋亡.     

新藤黄酸对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响

目的 观察新藤黄酸（gambogenic acid,GNA）对人表皮癌细胞A431增殖和凋亡的影响.方法 以体外培养的人表皮癌A431细胞株为研究对象,采用甲基噻唑基四唑检测GNA对A431细胞增殖活性的影响;倒置显微镜下观察GNA对A431细胞株细胞形态的影响;荧光显微镜下观察GNA对Hoechst 33342染色的A431细胞凋亡的影响;采用流式细胞仪检测膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙碇双染的A431细胞的凋亡率.结果 随着GNA剂量的增大,GNA对A431细胞增殖活性的抑制作用增强.倒置显微镜和荧光显微镜下观察显示,GNA作用的A431细胞形态发生明显的变化并出现显著的凋亡特征.流式细胞仪检测显示A431细胞凋亡率随着GNA作用剂量的增大而升高.结论 0.75～12.0 μmol/L GNA能够剂量依赖性地抑制A431的增殖.     

白蛋白对近端肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

 【目的】探讨白蛋白对近端肾小管上皮细胞（PTCs）增殖与凋亡的影响。【方法】用不同剂量（0．1，0．5，1，5，10，30mg／mL）去脂牛血清白蛋白（dBSA）超载体外培养的NRK52E，dBSA 0mg／mL作为对照。细胞增殖活性用MTS比色法检测和显微镜观察。细胞凋亡检测：荧光染料DAPI染核，DNA梯带实验，原位末端标记（TUNEL）实验和苔盼蓝染色计数。【结果】高剂量dBSA超载未完全融合NRK52E细胞144h后细胞变得更密集。MTS比色结果发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载可明显诱导NRK52E细胞增殖，增殖活性分别为（0．700±0．045）A、（1．021±0．029）A和（1．273±0．173）A，较对照细胞（0．441±0．020）A显著升高，P均〈0．05。高剂量dBSA超载的NRK52E细胞，有较多出现核碎裂和核固缩，有较强DNA梯带和原位末端标记信号。苔盼蓝染色计数发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载NRK52E细胞72h的死亡细胞数[（680000±28618）／mL，（970000±52915）／mL和（1132500±88954）／mL较对照的死亡细胞数[（312500±28395）／mL]显著升高，P均〈0．05；而且死亡细胞数呈剂量依赖性。【结论】白蛋白超载NRK52E细胞既可诱导细胞增殖，又可诱导细胞凋亡。     

白蛋白对近端肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】探讨白蛋白对近端肾小管上皮细胞（PTCs）增殖与凋亡的影响。【方法】用不同剂量（0．1，0．5，1，5，10，30mg／mL）去脂牛血清白蛋白（dBSA）超载体外培养的NRK52E，dBSA 0mg／mL作为对照。细胞增殖活性用MTS比色法检测和显微镜观察。细胞凋亡检测：荧光染料DAPI染核，DNA梯带实验，原位末端标记（TUNEL）实验和苔盼蓝染色计数。【结果】高剂量dBSA超载未完全融合NRK52E细胞144h后细胞变得更密集。MTS比色结果发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载可明显诱导NRK52E细胞增殖，增殖活性分别为（0．700±0．045）A、（1．021±0．029）A和（1．273±0．173）A，较对照细胞（0．441±0．020）A显著升高，P均〈0．05。高剂量dBSA超载的NRK52E细胞，有较多出现核碎裂和核固缩，有较强DNA梯带和原位末端标记信号。苔盼蓝染色计数发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载NRK52E细胞72h的死亡细胞数[（680000±28618）／mL，（970000±52915）／mL和（1132500±88954）／mL较对照的死亡细胞数[（312500±28395）／mL]显著升高，P均〈0．05；而且死亡细胞数呈剂量依赖性。【结论】白蛋白超载NRK52E细胞既可诱导细胞增殖，又可诱导细胞凋亡。     

脂氧素A4对Jurkat T细胞游离钙浓度变化及增殖的影响

目的 研究脂氧素A4(LXA4)对Jurkat T细胞内游离钙离子浓度变化及细胞增殖的影响.方法 钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载细胞后,用激光共聚焦扫描显微镜动态检测活细胞内游离钙离子浓度的变化;CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,并结合流式细胞仪进行细胞周期分析.结果 ①采用含钙细胞外液时,LXA4降低正常Jurkat T细胞内游离钙离子浓度,而用无钙细胞外液时,细胞内游离钙离子浓度下降不明显;②LXA4呈剂量依赖性抑制钙池操纵钙通道(SOC)激活剂thapsigargin(TG)引起的Jurkat T细胞内游离钙离子浓度的增高,100 nmol/L LXA4也能抑制抗CD3单抗(a-CD3)引起的细胞内钙离子浓度的增高,SOC阻滞剂2-Aminoethoxydiphenylborate(2-APB)能显著抑制TG引起的钙内流;③LXA4呈剂量依赖性抑制a-CD3和抗CD28单抗(a-CD28)诱导的Jurkat T细胞增殖,细胞周期分析发现LXA4阻止JurkatT细胞由G1期进入S期,降低S期细胞比例、细胞增殖指数(PI)和DNA含量.结论 LXA4可能通过抑制Jurkat T细胞钙池操纵的钙通道引起的胞质内游离钙浓度的升高而抑制其增殖.     

调控microRNA-99b表达对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用

 [目的] 探讨上调microRNA-99b(miR-99b)表达对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用及可能的机制。[方法] 宫颈癌SiHa细胞分正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组。利用siPORT NeoFX Transfection Agent，阴性对照组细胞转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control，miR-99b调控组细胞转染Pre-miR-hsa-miR-99b miRNA Precursor。实时定量PCR方法检测miR-99b表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测靶基因细胞分裂周期25A（CDC25A）蛋白表达。[结果] 实时定量PCR结果显示，miR-99b调控组细胞，miR-99b表达增加107.23倍。正常对照组、阴性对照组和miR-99b调控组细胞增殖率分别为（3.26±0.44）%、（3.65±0.47）%和（2.24±0.45）%，细胞凋亡率分别为（8.12±1.54）%、（8.75±1.67）%和（14.26±1.70）%，细胞CDC25A蛋白表达分别为0.50±0.06、0.59±0.05和0.31±0.05。与正常对照组和阴性对照组比较，miR-99b调控组细胞增殖率、凋亡率和CDC25A蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。[结论] 上调miR-99b表达可通过降低靶基因CDC25A表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，miR-99b可能成为宫颈癌治疗的靶基因。     

全反式维甲酸对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对人胃癌细胞增殖和细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法用不同浓度的全反式维甲酸处理人胃癌细胞AGS,采用MTT法观察处理前后细胞增殖的变化,应用流式细胞仪和Western印迹杂交法检测细胞凋亡。结果 ATRA显著抑制胃癌细胞增殖,具有时间和浓度依赖性。在0.5、1.0和5.0μmol/L浓度ATRA作用下,胃癌细胞增殖明显受到抑制,且随着作用时间的延长和浓度的增加,抑制作用越明显。ATRA 5.0μmol/L处理细胞72 h后,胃癌细胞凋亡率为15.32%,而对照组为3.31%,差异有统计学意义(P<0.01);并且ATRA处理后可观察到聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)的剪切降解,以及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3,-8和-9的激活。结论全反式维甲酸可抑制胃癌细胞的增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,其机制与Caspases的活化有关。全反式维甲酸在胃癌的治疗中可能具有潜在的应用前景。     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。     

参麦注射液对淋巴管内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨参麦注射液对淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells,LECs）增殖和凋亡的影响。方法取健康猪的胸导管内皮细胞进行分离、培养;采用Ⅷ因子、血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3）抗体联合对LECs进行鉴定;采用甲基噻唑基四唑（methyl thia-zolyl tetrazolium,MTT）染色法检测参麦注射液对LECs的生长抑制作用;采用Hoechst 33258荧光染色法检测LECs凋亡。结果形成了典型的LECs;当浓度为40~160μg/ml时,参麦注射液能明显抑制LECs的增殖,且抑制作用呈现剂量依赖关系;Hoechst 33258荧光染色检测证实,经参麦注射液处理后LECs,可观察到其核周围有凋亡小体。结论参麦注射液能抑制淋巴管生成和诱导LECs凋亡。     

熊果酸对前列腺癌细胞凋亡影响及其机制

目的:探讨熊果酸对前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡的影响及其机制。方法:体外培养PC-3细胞,用不同浓度的熊果酸处理24、48、72 h,MTT法测定其对PC-3细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察细胞的形态学变化;熊果酸(浓度分别为20、40、80μmol/L)处理PC-3细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡,分光光度计检测Casepase-3、Casepase-9相对活性,western blot法检测COX-2、PTEN基因表达情况。结果:熊果酸(浓度10~100μmol/L)能抑制PC-3细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态;熊果酸(浓度分别为20、40、80μmol/L)作用PC-3细胞48 h后,细胞凋亡率分别为12.5%、23.3%、35.4%,对照组凋亡率为3.4%;Casepase-3、Casepase-9的相对活性显著增加;COX-2的表达降低,而PTEN的表达升高,呈剂量依赖性。结论:熊果酸能抑制PC-3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调COX-2基因的表达及上调PETN基因并增加细胞Caspase-3、Caspase-9激活线粒体凋亡途径有关。熊果酸是一种前景广阔的抗肿瘤药物。     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。     

白藜芦醇诱导急性T淋巴母细胞白血病Jurkat细胞凋亡

目的：探讨白藜芦醇抑制急性T淋巴母细胞白血病Jurkat细胞增殖、引发S期阻滞和诱导凋亡的作用。方法：白藜芦醇体外处理培养的Jurkat细胞后,采用MTT法测定细胞活力,Wrigh-Giemsa染色、Hoechest 33258/PI荧光染色和透射电镜观察Jurkat细胞的形态学改变;流式细胞术分析细胞周期。结果：白藜芦醇0.2 mmol·L^-1处理组的抑制Jurkat细胞增殖率达64.01%,并具有剂量和时间依赖性。白藜芦醇处理细胞24 h后可见凋亡形态学改变,Hoechest 33258/PI染色显示白藜芦醇处理组细胞部分细胞核呈亮蓝色,随培养时间延长,亮蓝色荧光染色细胞数量逐渐增多。Wrigh-Giemsa染色和透射电镜观察发现部分细胞体积缩小、染色质浓缩及边集等现象的出现。流式细胞术检测表明,0.05 mmol·L^-1白黎芦醇处理48 h组62.57％的细胞被阻滞于细胞周期S期,亚二倍体细胞数量12.01%,未加药对照组细胞亚二倍体细胞数量2.05%。结论：白藜芦醇可以抑制Jurkat细胞的增殖,引起细胞周期的S期阻滞,并诱导其发生凋亡     

胆固醇缺乏对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨胆固缺乏时对Ｊｕｒｋａｔ细胞增殖功能及凋亡的影响。方法 用Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ抑制Ｊｕｒｋａｔ细胞内源性胆固醇的合成,以低浓度脂蛋白受体（ＬＤＬ－Ｒ）介导的低密谋脂蛋白（ＬＤＬ）内吞提供细胞外源性胆固醇,细胞处理１～３天后,用流式细胞仪分析各细胞周期相绫分布,并定量分析胆固醇缺乏对处理３天后细胞凋亡的影响。结果 Ｊｕｒｋａｔ经去脂血清培养基加Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ处理３天后,细胞受阻于Ｃｕ