APA微囊低温保存中降温方法的建立

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙(APA)微囊低温保存的降温方法。方法用静电法制作APA微囊,分别以程控降温法、冰箱梯度法或直接液氮法降温,最终将APA微囊保存于液氮中。复温后,在显微镜下观察APA微囊的破损情况,并用荧光标记的葡聚糖检测APA微囊膜通透性的变化。结果程控降温组为微囊完好率(91.2±1.57)%、皱缩率(3.1±0.81)%、破损率(5.7±2.62)%;冰箱梯度组为微囊完好率(85.3±1.42)%、皱缩率(5.2±0.74)%、破损率(9.5±3.81)%;直接冻存组为微囊完好率(14.5±1.57)%、皱缩率(84.1±3.47)%、破损率(1.4±2.62)%。冻存复温后,各组完好的APA微囊膜通透性无改变。结论程控降温法可较好地低温保存APA微囊并维持其通透特性。     

微囊化培养对肝细胞增殖生长和功能表达的影响

背景:前期研究证实,肝细胞在微囊化培养过程中结构形态发生变化,细胞的骨架会发生重排.目的:在前期研究基础上,进一步考察微囊化培养体系对细胞生长和功能表达的影响.方法:采用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化人肝癌细胞系HepG2细胞,通过显微观察、苏木精-伊红染色、MTT实验、Realtime RT-PCR与Elisa实验,检测微囊内细胞的生长形态、细胞团的形态结构、细胞的活性、以及细胞的功能表达情况.结果与结论:HepG2细胞在微囊内聚集成团,以三维方式生长,细胞间连接紧密,与传统的平面培养相比,微囊化细胞的生长速率减慢,但微囊化细胞的功能基因表达水平及白蛋白的分泌量增高,说明海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊所提供的微环境有利于肝细胞类组织的体外构建.结果也提示海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊能够实现肝细胞的体外类组织化培养,有望成为一种更具前景的三维培养模式,应用于癌症治疗、高通量药物筛选以及肝组织工程的研究.     

微囊化细胞的低温保存

背景:微胶囊是一种有效的免疫隔离工具,低温冷冻方便了微囊的保存与运输,有利于微囊化技术在临床的推广应用。目的:综述微囊低温保存技术中微囊低温保存特点、不同保存方法优缺点、研究方法及微囊低温保存实验现状。方法:检索1980/2010 PubMed数据库,1991/2010万方数据库、维普数据库有关微囊低温保存研究,低温保存工艺理论及专用仪器,微囊低温保存技术医学应用的文献。结果与结论:微囊化细胞在低温保存过程中的损伤特点与细胞、组织有很大不同。微囊相对较大的尺寸与复杂的囊壁半透膜结构,使得微囊结构与囊内细胞更容易受到溶质损伤与冰晶损伤,因此不能简单套用单细胞悬液的低温保存方案。慢速冷却法与玻璃化法是两种常见的微囊化细胞低温保存方法,各有利弊。微囊化细胞低温保存技术尚未成熟,在开发新型微囊低温保存设备,优化设计微囊低温保存方案的同时,需进一步加强对微囊冻存机制更深层次的探索。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景:目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。目的:观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。方法:取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1mol/L二甲基亚砜,0.1mol/L海藻糖,0.1mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.3mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。结果与结论:免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜处理和经0.1mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20mol/L。     

微囊化细胞的低温保存

背景：微胶囊是一种有效的免疫隔离工具,低温冷冻方便了微囊的保存与运输,有利于微囊化技术在临床的推广应用。目的：综述微囊低温保存技术中微囊低温保存特点、不同保存方法优缺点、研究方法及微囊低温保存实验现状。方法：检索1980/2010 PubMed数据库,1991/2010万方数据库、维普数据库有关微囊低温保存研究,低温保存工艺理论及专用仪器,微囊低温保存技术医学应用的文献。结果与结论：微囊化细胞在低温保存过程中的损伤特点与细胞、组织有很大不同。微囊相对较大的尺寸与复杂的囊壁半透膜结构,使得微囊结构与囊内细胞更容易受到溶质损伤与冰晶损伤,因此不能简单套用单细胞悬液的低温保存方案。慢速冷却法与玻璃化法是两种常见的微囊化细胞低温保存方法,各有利弊。微囊化细胞低温保存技术尚未成熟,在开发新型微囊低温保存设备,优化设计微囊低温保存方案的同时,需进一步加强对微囊冻存机制更深层次的探索。     

海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植改善帕金森病模型鼠的旋转行为

背景:细胞组织的微囊化移植是近年来帕金森病治疗的研究热点之一,目前发展较成熟、应用较多的是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊,但其易于囊周纤维化、易破碎等缺点,使其临床应用受到了限制。应用国内研制的新型微胶囊材料海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊将PC12细胞微囊化后移植入帕金森病模型鼠纹状体内,观察其作用。目的:观察海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植治疗,改善帕金森病模型大鼠旋转行为的作用。设计:随机对照动物实验。单位:吉林大学第二医院和中国科学院大连化学物理研究所。材料:成年雄性Wistar大鼠40只,体质量(220±10)g;海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊;PC12细胞。方法:实验于2002-05/12在吉林大学第二医院动物实验室和中国科学院大连化学物理研究所完成。①应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞。②将成功建立的23只帕金森病大鼠模型随机分为3组,微囊化PC12细胞组10只、裸PC12细胞组7只、空微胶囊组6只。分别将海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞、裸PC12细胞、空微胶囊移植入帕金森病模型鼠损伤侧纹状体内。③以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异。观察黑质及纹状体内微包囊的形态并检测微胶囊内细胞的活性。主要观察指标:①移植前后大鼠的旋转行为。②黑质和纹状体的病理形态。③回收的微包囊的完整性及囊内PC12细胞的活性。结果:①微囊化PC12细胞移植组在移植4周时旋转行为显著低于移植前和空微囊移植组犤(6.9±2.8),(11.7±5.5),(10.5±1.6)r/min,P<0.05犦,症状改善至少持续3个月;裸PC12细胞移植组大鼠的旋转行为与移植前相比也有改善犤(5.6±1.1),(9.5±1.5)r/min,P<0.05犦,但仅持续了2个月,且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成。空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异。②回收微胶囊内的PC12细胞再培养生长良好,并且具有生物活性。结论:微囊化PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的帕金森病模型鼠的旋转症状,海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠新型微胶囊具有免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用,有着广泛的临床应用前景。     

不同保存方式下嗅鞘细胞的活性

背景:获取和寻找适合的保存方式对嗅鞘细胞实验和临床应用有重要的意义.目的:探索合适的嗅鞘细胞低温保存方式.方法:取对数期生长的嗅鞘细胞,冻存1,3,6 个月进行复苏.结果与结论:MTT 比色法及锥虫蓝染色显示5%二甲基亚砜-6% 羟乙基淀粉处理的细胞活性最高,其次是10%二甲基亚砜处理的细胞,5%二甲基亚砜的保护作用最差.冰箱降温或程控降温仪降温方式及不同的冻存时间对嗅鞘细胞活性影响不明显.因此,推荐用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉作为嗅鞘细胞冻存低温保护剂.     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1mol/L二甲基亚砜,0.1mol/L海藻糖,0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜处理和经0.1mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20mol/L。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景:在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的:比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法:将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论:两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

骨髓、脐血、外周血干细胞-80℃保存研究

骨髓、脐血、外周血干细胞－８０℃保存研究２０００５１上海市血液中心范华骅马庆柏乃庆造血干细胞的体外长期保存一般采用１０％二甲基亚砜低温保护剂，程序降温后贮存在液氮中［１～３］，这种方法需要程序降温仪、液氮罐等价格昂贵的低温保存设备，且比较复杂、费时。...     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的：比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义（P〉0.05）。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响

背景：冻存是保证干细胞移植治疗的关键步骤之一。传统的冻存是将细胞直接置于冻存液中进行保存,然而冻存液中二甲基亚砜虽能减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜产生的机械性损伤,但同时又对细胞具有毒性作用,直接影响细胞生存状态,不利于临床移植治疗。目的：寻找适宜牙周膜干细胞体外扩增的牙周周组织冻存的最佳方案。方法：收集健康人牙,刮取牙周组织后将其平均分为3等份,随机分为新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组,后2组分别以体积分数5%和10%二甲基亚砜添加冻存1个月后提取牙周膜干细胞。新鲜组直接提取牙周膜干细胞。结果与结论：5%二甲基亚砜组原代细胞游出组织团块所需时间和细胞收获量虽不及新鲜培养组,但却明显优于10%二甲基亚砜组（P〈0.05）。新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组第1代牙周膜干细胞克隆形成率、活细胞比率、第3代牙周膜干细胞BrdU细胞增殖能力、MTT细胞生长曲线和牙周膜干细胞表面标志物表达差异没有显著性意义（P〉0.05）。提示5%二甲基亚砜添加冻存体系不仅能比10%二甲基亚砜添加的普通冻存体系明显缩短牙周膜干细胞体外扩增所需时间,增加细胞收获量同时还能保持细胞基本生物学特性,降低二甲基亚砜的总体用量和其在反复冻存复苏细胞过程中对细胞造成的直接损伤,为未来更加安全的实施临床移植治疗提供了保障,是供体组织储存新的选择。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景:非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床.目的:观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响.方法:分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组.采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平.结果与结论:4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05).透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显.单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右.造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤.提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用.     

Effect of cryopreservation on the immunogenicity of umbilical cord blood cells.

Cryopreservation is the accepted method for long-term storage of cord blood (CB) cells. We evaluated the effects of using different cooling rates (1, 5, 7.5 and 10 degrees C/min) on CB cell allostimulatory and alloproliferative function, antigen expression and clonogenic potential. Significant decreases (P<0.001-0.003) in viable cell recovery observed between fresh CB cells and CB cells cryopreserved at each cooling rate tested. Reductions in clonogenic potential of CB cells cryopreserved at cooling rates of 1, 5, 7.5 and 10 degrees C/min were 44%, 76%, 88% and 93% respectively, compared to fresh controls. FACS analysis indicated no changes in percentages CD34+ cells or lymphocytes. Two sets of mixed lymphocyte reactions were carried out for each CB sample. It was observed that allostimulatory and alloproliferative function varied following cryopreservation at different cooling rates (1 and 5 degrees C/min). Interestingly, there was a significant decrease (P<0.001-0.04) in the alloproliferative function of six of the seven CB samples following cryopreservation using a cooling rate of 5 degrees C/min. Cooling rates between 1 and 5 degrees C/min may provide immunomodulation of CB with maintenance of haematopoietic progenitor cells function.     

Collection strategies and cryopreservation of umbilical cord blood

The aim of this study was to compare (a) two different umbilical cord blood (UCB) collection methods while the placenta is still in the uterus (in utero), and (b) to evaluate the efficacy of four cryopreservation protocols based on UCB haematopoiestic stem cell (HSC) recovery. We analysed UCB samples collected with our original collection system designed for active Syringe/Flush/Syringe method or by standard in utero method. For comparing different cryopreservation procedures, dimethyl sulphoxide (DMSO) at final concentration of 5 and 10% was used and combined with our own controlled-rate or uncontrolled-rate cryopreservation. A total of 99 samples were collected. A significantly higher UCB volume, total nucleated cell and mononuclear cell were seen following the first collection strategy (n= 49; mean +/- SD, 103 +/- 35.4 mL; 12.34 +/- 5.27 x 10(8); 595 +/- 3.47 x 10(6)) vs. the second strategy (n= 50; 86 +/- 29.3 mL; 9.87 +/- 4.47; 424 +/- 2.82 x 10(6)) respectively (P < 0.01). The discard rate was 14% for the first and 36% for the second collection strategy (P < 0.01). It was shown that the most efficient procedure was the controlled-rate protocol combined with lower (5%) DMSO concentration. Using active Syringe/Flush/Syringe method, we collected UCB with greater volumes and with lower discard rate compared to the standard by gravity technique. The data presented also showed much better recovery of UCB cells when controlled-rate freezing procedure and 5% DMSO were combined.     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。目的：观察不同冷冻保护剂对-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25mol/L海藻糖组。采用-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义（P〉0.05）。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45＋细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

Bio‐inspired solute enables preservation of human oocytes using minimum volume vitrification

The ability to cryopreserve human oocytes has significant potential for fertility preservation. Current cryopreservation methods still suffer from the use of conventional cryoprotectants, such as dimethyl sulphoxide (DMSO), causing loss of viability and function. Such injuries result from the toxicity and high concentration of cryoprotectants, as well as mechanical damage of cells due to ice crystal formation during the cooling and rewarming processes. Here we report the preservation of human oocytes following vitrification using an innovative bio‐inspired cryoprotectant integrated with a minimum volume vitrification approach. The results demonstrate that the recovered human oocytes maintained viability following vitrification and rewarming. Moreover, when this approach was used to vitrify mouse oocytes, the recovered oocytes preserved their viability and function following vitrification and rewarming. This bio‐inspired approach substitutes DMSO, a well‐known toxic cryoprotectant, with ectoine, a non‐toxic naturally occurring solute. The bio‐inspired vitrification approach has the potential to improve fertility preservation for women undergoing cancer treatment and endangered mammal species.