骨修复用胶原复合支架材料研究进展

胶原蛋白作为骨组织工程支架材料具有许多优点，章综述了骨修复用胶原复合支架材料的研究现状，仿天然骨成分、结构和特性胶原复合支架材料是骨组织工程研究发展的趋势。     

骨修复用胶原复合支架材料研究进展

胶原蛋白作为骨组织工程支架材料具有许多优点,文章综述了骨修复用胶原复合支架材料的研究现状,仿天然骨成分、结构和特性胶原复合支架材料是骨组织工程研究发展的趋势。     

新型胶原支架材料改性的研究

针对脱细胞真皮基质作为复合移植用真皮支架所存在的渗透性较差、降解速率慢、生物活性低等缺点,采用新工艺技术制备了天然三维网络结构的新型胶原支架材料,探讨交联、复合及其顺序和打孔对其理化性能的影响,并通过成纤维细胞培养试验研究其生物相容性.理化性能检测结果显示:复合提高交联试样的孔隙率和延长降解时间;交联明显提高试样的孔隙率和拉伸强度并延长其降解时间;先复合后交联可以提高孔隙率和降解时间;打孔可以明显提高材料的透水汽性和孔隙率.成纤维细胞培养试验表明:成纤维细胞能在改性支架材料上黏附、增殖.新型胶原支架经复合、交联、打孔改性后,其透水汽性明显提高,达到(3372±83)g/(m2·d);孔隙率显著提高,达(94.20±2.5)%;拉伸强度较好,为(10.65±0.32)MPa;体外降解时间为(38.3±1.0)h,通过适当改变交联剂的用量在比较宽的范围,可以满足不同支架材料降解速率的要求;细胞相容性良好.新型胶原支架经复合、交联、打孔改性后有望作为复合移植用的真皮支架.     

胶原复合梯度磷酸三钙负载软骨细胞的体外培养

目的 观察新型三维支架材料胶原复合梯度磷酸三钙在体外与软骨细胞的相容性和黏附性,评价其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 取8周龄新两兰大白兔膝关节软骨,以酶消化法获得高纯度软骨细胞,培养3代后与三维支架材料胶原复合梯度磷酸三钙在体外复合培养.用倒置相差显微镜、HE染色、免疫组织化学及扫描电镜观察软骨细胞形态、Ⅱ型胶原表达及成软骨能力,同时观察支架材料与软骨细胞的相容性.结果 扫描电镜观察显示支架材料具有疏松多孔结构,孔隙结构规则,孔径100～150 μm,材料内部孔与孔之间贯通良好.支架亲水性好.软骨细胞吸附于支架表面,增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部,在孔壁贴附良好,表型维持稳定,可分泌细胞外基质.结论 胶原复合梯度磷酸三钙三维支架具有良好的细胞相容性.     

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

背景：前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。 目的：探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。 方法：从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下,加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导,在诱导14 d时,采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7,14和21 d时,采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况。 结果与结论：原代脂肪干细胞贴壁生长,呈梭形、多角形分布,细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性,CD106 阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好,增殖能力旺盛,细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。     

壳聚糖-聚乳酸软骨与软骨下骨复合支架的制备与表征*

目的制备羟乙基壳聚糖-g-左旋聚乳酸（HECS-g-PLLA）和羟乙基壳聚糖-g-左旋聚乳酸＋Ⅱ型胶原蛋白（HECS-g-PLLA＋II型胶原蛋白）复合支架,并进行表征。方法采用热致相分离法制备HECS-g-PLLA、HECS-g-PLLA＋II型胶原蛋白聚合物,再用压片机,设定不同大气压,将聚合物压模成形具有不同性能的复合支架,测定复合支架的微观形貌、红外光谱、压缩模量、孔隙直径及生物相容性。结果复合支架具有纳米微米共存的高孔隙直径的亚微观结构。红外光谱显示壳聚糖成功羟乙基化,羟乙基壳聚糖与左旋聚乳酸聚合成功。随着压片机设定的压模成形的大气压力增大,样品的压缩模量增强,但空隙直径逐渐减少,可以根据需要制作各种不同性能的支架。结论热源实验和全身急性毒性实验提示复合支架浸提液注入动物体内不会引起发热反应和毒性反应,具有良好的生物相容性。     

新型角膜支架材料的制备及生物相容性研究

首先合成了一种新型可降解的三乙烯基交联剂,并以偶氮二异丁氰(A IBN)为引发剂与乙烯基吡咯烷酮(NVP)通过自由基聚合制备了一种新型的交联NVP角膜支架材料。对材料的吸水率、接触角和降解性能进行了测定,通过体内埋植实验和细胞培养对材料进行了生物相容性评价。结果表明材料的吸水率达到104%,接触角为41,°降解速率较为恒定;体内埋植实验研究表明,3个月后,材料已大部分降解,材料内出现胶原和角膜基质细胞,周围组织无明显的炎症反应;细胞培养实验表明,角膜上皮细胞在材料上可以较好的生长,没有明显的细胞毒性,具有良好的生物相容性,这种合成的新型交联NVP角膜支架材料将在角膜组织工程中具有潜在的应用价值。     

新型壳聚糖-胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性

背景：目前胶原作为牙周组织工程支架材料仍具有机械强度差、降解速度快等缺点,将其与壳聚糖复合可改善上述问题。 目的：评估新型壳聚糖-胶原支架材料的体外生物相容性。 方法：通过MTT法评估100%,75%,50%,25%壳聚糖-胶原支架材料浸提液对人牙周膜细胞的毒性。选择第4-6代生长状态良好的人牙周膜细胞与壳聚糖-胶原支架共培养,观察细胞在支架上的生长情况,并检测与壳聚糖-胶原支架复合培养前后人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的变化。 结果与结论：新型壳聚糖-胶原支架具有双层结构,一侧表面致密,一侧表面疏松多孔。MTT法检测不同浓度材料浸提液毒性评级为0或1级。扫描电子显微镜及组织学观察可见细胞在壳聚糖-胶原支架上增殖良好,且致密层可起屏障膜作用,阻挡细胞进入支架内部;复合培养24 h后,人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性与复合培养前无明显差异(P > 0.05),复合培养48,72 h后人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性高于复合培养前(P < 0.05)。以上结果提示新型壳聚糖-胶原支架具有良好的生物相容性及屏障功能,可进一步应用于牙周组织工程的研究。     

猪源性骨支架材料的制备及性能研究

目的:制备猪源性骨支架材料,并与人源性骨支架材料对比检测其理化性能和组织相容性。方法:经低温深冻、超声清洗、H2O2、酒精浸泡、冻干、辐照制备猪源性骨支架材料和人源性骨支架材料。扫描电镜观察,测定材料孔隙率、蛋白质含量、钙磷含量及弹性模量。2种材料的浸提液与脂肪源间充质干细胞复合培养,观察细胞一般形态,流式细胞仪PI法检测细胞生命周期。皮下植入2种材料,在植入4、8、12、16周取材做病理切片观察和扫描电镜观察。结果:2种材料均具有骨本身的天然网状三维支架系统。猪源性骨支架材料的孔隙率高于人源性骨支架材料,蛋白含量低于人源性骨支架材料,弹性模量分别为无显著差异。材料浸提液组及空白对照组的细胞生长状态良好。流式细胞仪PI法检测细胞周期见G1期、G2期细胞百分率接近。皮下植入试验表明,随着植入时间的延长,炎症反应逐步减轻,材料降解增加,新生软骨样结构逐渐增多。结论:猪源性异种骨支架材料在理化性能和材料毒性等方面与同种异体骨支架材料接近,具有良好的应用前景。     

天然胶原半月板组织工程支架修复运动半月板损伤

背景：可吸收天然胶原支架材料是成熟和理想的半月板替代物。 目的：总结半月板组织工程学研究的现状。 方法：以“组织工程学、运动性半月板损伤、种子细胞、可吸收天然胶原、生物支架材料、应力刺激、力学因素”为中文关键词,以“Tissue engineering、Movement of the meniscus、Seed cells、Natural collagen can be absorbed、Biological scaffolds、Stress stimulation、Mechanical factor”为英文关键词,采用计算机检索PubMed数据库和维普数据库中1994年1月至2011年12月与运动性半月板损伤及半月板组织工程研究相关的文章。 结果与结论：目前的研究重点包括半月板损伤机制、可吸收天然胶原作为半月板组织工程支架的可行性分析、应力刺激、半月板恢复力学因素4个方面。研究表明半月板组织工程修复运动性半月板损伤具有良好的应用前景和广阔的使用空间,但在实际应用中,半月板组织工程支架的构建、细胞外基质复合材料的研究及其与组织的相容性,修复后组织工程半月板的应力刺激和所能承受的力学因素问题仍是半月板组织工程学方面的难点问题。     

旋转细胞培养系统培养的山羊软骨细胞

 目的 探讨用旋转细胞培养系统（RCCS）进行大动物软骨细胞扩增的可行性。方法 将单层培养的具有正常表型的中国山羊软骨细胞和Cytodex-3微载体放入RCCS的培养容器中,加入DMEM 培养基进行培养。在细胞培养的第3、6、9、12 天,于倒置显微镜下观察Cytodex-3微载体表面软骨细胞生长形态及增殖变化情况,并对收获的软骨细胞进行蕃红花"O"染色和Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色分析。结果 软骨细胞贴附于微载体表面生长,细胞初期呈球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多。收获的软骨细胞蕃红花"O"染色呈强阳性,Ⅰ型胶原染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论 利用RCCS可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,培养的软骨细胞具有正常的表型,能特异性分泌软骨组织特有的基质成分。     

Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture

Three dimensional gels of aligned collagen fibers were patterned in vitro using microfluidic channels. Collagen fiber orientation plays an important role in cell signaling for many tissues in vivo, but alignment has been difficult to realize in vitro. For microfluidic collagen fiber alignment, collagen solution was allowed to polymerize inside polydimethyl siloxane (PDMS) channels ranging from 10–400 μm in width. Collagen fiber orientation increased with smaller channel width, averaging 12 ± 6 degrees from parallel for channels between 10 and 100 μm in width. In these channels 20–40% of the fibers were within 5 degrees of the channel axis. Bovine aortic endothelial cells expressing GFP-tubulin were cultured on aligned collagen substrate and found to stretch in the direction of the fibers. The use of artificially aligned collagen gels could be applied to the study of cell movement, signaling, growth, and differentiation.     

人皮肤成纤维前体细胞的分离培养及其功能鉴定

目的以人的皮肤为材料,拟在体外成功分离培养成纤维前体细胞并研究其除皱整形能力。方法组织块法分离人的皮肤成纤维前体细胞,并通过RT-PCR、流式细胞仪、软琼脂克隆等实验技术对分离的皮肤成纤维前体细胞进行鉴定,同时进行免疫荧光、动物实验检测其在治疗真皮损伤以及除皱整形方面的作用。结果成功分离并扩增人的皮肤成纤维前体细胞,优化了原代细胞的分离方法,RT-PCR和流式细胞仪检测结果显示该细胞表达部分干细胞表面标记HLA-I、HLA-DR、CD90以及CD105,软琼脂克隆实验表明该细胞不具有致瘤性。免疫荧光结果显示,注射该细胞的裸鼠与对照组相比,真皮层产生更多的I型胶原蛋白,皮肤厚度增加。结论一次取材,体外能够成功持续获得人的原代皮肤成纤维前体细胞,优化了原代细胞分离方法。并且该细胞注射后可以在一定程度上分化为成纤维细胞,产生胶原蛋白,修复受损皮肤。     

静电纺丝构建胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素组织工程关节软骨支架的工艺探索

目的探索以胶原、透明质酸钠和硫酸软骨素三种细胞外基质为原料,利用静电纺丝技术构建组织工程关节软骨支架的工艺。方法固定静电纺丝的参数,通过改变溶剂的种类,浓度和三种原料之间的比例,探索胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合支架的纺丝条件。结果胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合支架纺丝的最佳溶剂是3-氟乙醇和水的混合溶剂(v:v,1:1),最佳纺丝浓度范围为80~120mg/m L,三种原料支架的最佳比例范围为6~8:1:1~2。支架纤维的直径和孔隙率则由原料的浓度和比例共同决定;支架降解性能良好,降解速度主要由胶原含量决定。结论研究者成功的利用静电纺丝技术构建了胶原-透明质酸钠-硫酸软骨素复合组织工程软骨支架。这种支架在成分和形态上都可以较好的模拟关节软骨细胞外环境,是一种具有良好应用前景的组织工程关节软骨支架。     

In vitro cultivation of canine multipotent mesenchymal stromal cells on collagen membranes treated with hyaluronic acid for cell therapy and tissue regeneration

Support structures for dermal regeneration are composed of biodegradable and bioresorbable polymers, animal skin or tendons, or are bacteria products. The use of such materials is controversial due to their low efficiency. An important area within tissue engineering is the application of multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) to reparative surgery. The combined use of biodegradable membranes with stem cell therapy may lead to promising results for patients undergoing unsuccessful conventional treatments. Thus, the aim of this study was to test the efficacy of using membranes composed of anionic collagen with or without the addition of hyaluronic acid (HA) as a substrate for adhesion and in vitro differentiation of bone marrow-derived canine MSCs. The benefit of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the differentiation of cells in culture was also tested. MSCs were collected from dog bone marrow, isolated and grown on collagen scaffolds with or without HA. Cell viability, proliferation rate, and cellular toxicity were analyzed after 7 days. The cultured cells showed uniform growth and morphological characteristics of undifferentiated MSCs, which demonstrated that MSCs successfully adapted to the culture conditions established by collagen scaffolds with or without HA. This demonstrates that such scaffolds are promising for applications to tissue regeneration. bFGF significantly increased the proliferative rate of MSCs by 63% when compared to groups without the addition of the growth factor. However, the addition of bFGF becomes limiting, since it has an inhibitory effect at high concentrations in culture medium.     

肿瘤细胞三维培养支架、血管及细胞间的相互作用

背景：肿瘤组织工程通过构建综合的培养模型,充分模拟肿瘤在体内生长的微环境,可以较好地研究肿瘤发生发展的动力学及相关治疗策略。 目的：综述肿瘤工程技术中的肿瘤细胞三维培养。 方法：以“tumor engineering; 3D culture; biological materials; dynamic”为关键词,检索PubMed数据库1992年1月至2013年3月相关文献,纳入有关肿瘤工程、肿瘤细胞三维培养、生物支架材料及肿瘤微环境的相关文章。 结果与结论：三维培养因其可再现组织细胞的体内生长情况,已成为研究肿瘤耐药性、侵袭性和肿瘤微环境的重要平台,在许多领域表现出逐步取代平面培养技术的趋势,为肿瘤研究提供了一个非常接近于体内真实情况的研究平台。近年来,随着肿瘤工程学的发展,多种新型高分子聚合材料被应用于肿瘤细胞的三维立体培养,三维培养技术逐渐成为肿瘤生物学领域研究的热点,其利用各种方法及材料使细胞呈空间立体方式生长,形成类似体内生长环境的生物支撑或基质,建立细胞间及细胞与胞外基质间的相互联系,并形成特定的类似组织样的三维空间结构。生物材料就是种子细胞生长的土壤,在肿瘤工程中起着替代细胞外基质或组织、器官的基质的作用。而随着三维细胞培养技术在肿瘤研究中的广泛应用,其已成为肿瘤耐药、血管形成、细胞间相互作用、信号转导、干细胞等方面研究不可或缺的有力工具。     

京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架的构建及其细胞毒性和组织相容性的研究

目的探讨京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架的构建及其细胞毒性和组织相容性。 方法以牦牛跟腱为材料,用酶-酸法进行粗提,结合高效液相色谱进行胶原蛋白的分离、纯化,加入交联剂构建京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架及京尼平-壳聚糖标准I型胶原蛋白支架。将L929小鼠胚胎成纤维细胞接种于浇注2种支架的孔板上,分别培养1、3、5、7、9、11 d,倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数试剂盒-8进行细胞增殖/毒性实验,计算细胞活力。将2种蛋白支架材料分别移植于同一只大鼠脊柱2侧深筋膜层,分别于移植后3、5、7、9 d取材,10%中性福尔马林液固定,石蜡包埋、切片,苏木精-伊红染色,显微镜下观察胶原降解情况,血管长入情况。数据比较采用t检验。 结果培养1、3、5、7、9、11 d,接种于浇注京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架与京尼平-壳聚糖标准I型胶原蛋白支架的孔板的L929小鼠胚胎成纤维细胞细胞活力分别为(3.14±0.04)%、(2.17±0.13)%、(2.60±0.11)%、(1.78±0.02)%、(1.64±0.32)%、(1.12±0.02)%,(2.96±0.07)%、(2.08±0.10)%、(2.68±0.14)%、(1.75±0.02)%、(1.84±0.01)%、(1.14±0.01)%,比较差异均无统计学意义(t＝－2.15、－1.31、1.22、－1.27、1.51、0.54, P＝0.06、0.22、0.25、0.25、0.16、0.63)。活体组织相容性实验,大鼠全部存活,手术切口愈合良好,未见急性炎症和局部积液、积脓改变。移植3、5、7、9 d取材,京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架和京尼平-壳聚糖标准I型胶原蛋白支架均仍未降解,局部组织长入经交联的支架中,支架内见炎性细胞增殖,出现血红细胞及新生小血管。 结论京尼平-壳聚糖牦牛跟腱胶原蛋白支架生物安全性良好,具有作为组织工程支架的潜力。     

No donor age effect of human serum on collagen synthesis signaling and cell proliferation of human tendon fibroblasts

The aging process of tendon tissue is associated with decreased collagen content and increased risk for injuries. An essential factor in tendon physiology is transforming growth factor-β1 (TGF-β1), which is presumed to be reduced systemically with advanced age. The aim of this study was to investigate whether human serum from elderly donors would have an inhibiting effect on the expression of collagen and collagen-related genes as well as on cell proliferative capacity in tendon cells from young individuals. There was no difference in systemic TGF-β1 levels in serum obtained from young and elderly donors, and we found no difference in collagen expression when cells were subjected to human serum from elderly versus young donors. In addition, tendon cell proliferation was similar when culture medium was supplemented with serum of different donor age. These findings suggest that factors such as the cell intrinsic capacity or the tissue-specific environment rather than systemic circulating factors are important for functional capacity throughout life in human tendon cells.     

纳米级多孔负载人骨形成蛋白2基因修饰支架对前成骨细胞株分化的影响

BACKGROUND: Bone tissue transplantation or osteogenic material filling is after used for bone defect repair. To remove autologous bone tissues can lead to additional damage and secondary deformity, therefore, it is extremely urgent to search for a new osteogenic material. OBJECTIVE: To construct the porous β-tricalcium phosphate (β-TCP)/collagen scaffold modified with human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene, and to observe its effects on differentiation of MC3T3-E1 cell lines. METHODS: The porous β-TCP/collagen scaffold modified with hBMP2 gene was prepared. Then in vitro culture system of MC3T3-E1 cell lines with composite scaffold was established. There were scaffold and plate groups, and each group was divided into two subgroups according to the different concentrations of plasmid. Samples were collected and observed morphologically by scanning electron microscope and light microscope after complex culture. After 1, 3, 7 and 14 days of induction, calcium nodules were observed through alizarin red staining, the cell cycle was detected by real-time PCR, and expressions of α I-chain collagen type I gene, Osterix and bone sialoprotein were observed. RESULTS AND CONCLUSION: The number of cells adhered, differentated and distributed on the composite scaffold was significantly higher than that of the single scaffold (P < 0.05). Alizarin red staining and real-time PCR detection showed that the osteogenesis ability of MC3T3-E1 cell lines in the scaffold group was stronger than that in the plate group. To conclude, the porous β-TCP/collagen scaffold modified with hBMP2 gene is an appropriate candidate for bone defect repair.     

压力下角质形成细胞与成纤维细胞共培养对细胞增殖及胶原合成的影响

目的研究压力下人角质形成细胞(human keratinocytes,HKC)和人成纤维细胞(human fibroblasts,HFB)的三维共培养对细胞增殖及胶原蛋白合成的影响。方法将HKC与HFB分别接种于壳聚糖-明胶支架2 d后,将气-液界面诱导分化1 d后的HKC-壳聚糖-明胶复合物与HFB-壳聚糖-明胶复合物共培养12 h,3.4 k Pa气体压力加载24 h,并以压力单独培养、无压力单独培养或无压力共培养作为对照。HE染色观察细胞在支架中的分布及生长情况,MTT法测定细胞增殖情况,羟脯氨酸试剂盒测定上清液中的胶原含量。结果 HE染色发现,HKC与HFB均可以在壳聚糖-明胶支架上正常增殖成片;3.4 k Pa压力或共培养均可以促进HKC增殖和胶原合成,抑制HFB增殖及胶原合成。结论压力及共培养是影响HKC与HFB增殖及胶原蛋白合成的重要因素,研究结果为手术切除瘢痕后移植组织工程表皮结合压力法治疗增生性瘢痕的可能机制提供参考。