HNP对肺炎克雷伯杆菌粘附呼吸道上皮细胞的影响

目的：探讨呼吸道抗感染防御机制,观察人中性粒细胞α-防御素（HNP）对肺炎克雷伯杆菌粘附呼吸道上皮细胞的影响。方法：从人中性粒细胞分离纯化HNP。A549细胞与HNP（20μg·ml^-1）及两株肺炎克雷伯杆菌临床分离株共同孵育4小时,用平板培养茵落计数法测定与细胞粘附的活茵数。结果：在HNP存在的情况下,Kp03.33株细菌对肺上皮细胞的粘附提高了12倍（P〈0.01）,Kp03116株细菌对上皮细胞的粘附提高了5倍（p〈0.01）结论：HNP显著增强肺炎克雷伯杆菌粘附于呼吸道上皮细胞,可能有利于呼吸道清除细菌。     

TNF-α增强膀胱上皮细胞清除细胞内肺炎克雷伯杆菌

研究TNF-α对膀胱上皮细胞内肺炎克雷伯杆菌生存的影响。方法：以肺炎克雷伯杆菌侵入体外培养的人膀胱上皮细胞（T24细胞）为模型,观察在TNF-α等细胞因子处理条件下,不同时间点细胞内细菌数量变化。结果：单独使用TNF-α使T24细胞内的肺炎克雷伯杆菌K5株细菌数量明显减少,联合使用TNF-α与IFN-γ使胞内活菌数量更显著的减少。而IL-1β对细胞内活菌数量无明显影响。过氧化氢酶可以有效抑制TNF-α与IFN-γ刺激的＂1＂24细胞抗菌作用,而一氧化氮合酶抑制剂L-NAME无抑制作用。结论：TNF-α能够增强膀胱上皮细胞对抗细胞内肺炎克雷伯杆菌,抗菌机制与细胞产生活性氧（ROS）有关。     

肺炎克雷伯菌生物膜相关研究进展

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床常见的院内感染致病菌,常引起泌尿系统、呼吸系统以及血流感染等。近年来,肺炎克雷伯菌生物膜引起的慢性感染日益得到重视,对肺炎克雷伯菌生物膜的研究也越来越多。为了适应周围环境,肺炎克雷伯菌会形成生物膜(biofilm),这是一种相对于浮游细菌的生存方式,生物膜由细菌及其自身分泌的代谢产物(胞外多糖、蛋白质、胞外DNA、脂质等)组成。生物膜状态下的肺炎克雷伯菌耐药性极强,容易逃避机体的免疫攻击,难以彻底清除,使临床抗感染变得更加棘手。本文就生物膜形成过程、生物膜状态细菌的耐药机制、生物膜测定方法以及生物膜防治作简要综述。     

黄连素对肺炎克雷伯菌生长曲线的影响

目的 探讨黄连素与环丙沙星对肺炎克雷伯菌（Kpn）生长曲线的影响.方法 2012年1月至2012年7月本院细菌室收集的42株临床Kpn菌株,药敏试验筛选出环丙沙星和黄连素均有效的敏感株6株,命名为S1～S6;耐药株6株,命名为R1 ～R6.每个菌株分为4个实验小组：空白对照组、环丙沙星组、黄连素组、环丙沙星＋黄连素组.空白对照组不进行任何处理;根据前期单用环丙沙星与黄连素测定的最低抑菌浓度（MIC）,黄连素浓度均使用500 mg/L,环丙沙星的浓度≤1/2 MIC.利用比浊法测定6株耐药株和6株敏感株Kpn的各实验小组在培养时间为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h的吸光度（A600nm值）并绘制生长曲线.结果 生长曲线显示黄连素500 mg/L对临床耐药和敏感Kpn的生长曲线均有影响,当黄连素与环丙沙星联合应用时对其生长的抑制效应加大.临床耐药和敏感Kpn的生长曲线并无明显差异.结论 黄连素能增加临床耐药Kpn对环丙沙星的敏感性.     

肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究进展

喹诺酮类药物作为广谱抗菌药物，已被广泛应用于革兰阴性肺炎克雷伯菌的治疗，而肺炎克雷伯菌为了不被杀灭产生对喹诺酮耐药的分子机制成为细菌治疗研究的热点之一。本文对肺炎克雷伯耐喹诺酮的主要机制及目前的研究进展作一综述。     

2012～2016肺炎克雷伯菌分布及耐药变化趋势分析

目的 对2012～2016年医院患者肺炎克雷伯菌(KPN)感染现状及耐药性进行调查,为感染监控和临床用药提供参考.方法 回顾性分析2012 ～2016年医院患者细菌培养标本中KPN的分离情况及耐药性的变迁趋势.结果 共分离KPN 2043株,逐年总体分离率无明显变化,产ESBLs菌株的分离率2012 ～2014年逐年下降,而2014 ～2016年则逐年上升,CRKP的分离率则逐年显著上升,2016年CRKP分离率达42.53％.临床分离的KPN主要来源于痰、全血、尿液、分泌物和引流液标本,2012 ～2016年痰标本的分离率呈逐年下降趋势,而全血的分离率呈逐年递增趋势.其他标本类型的分离率亦有一定的波动,分离KPN阳性率较高的病区是重症医学科、神经外科、呼吸科、老年病科和肾内科等,除重症医学科的分离率逐年上升外,其余病区无明显变化.碳青霉烯类耐药率逐年显著上升,2016年达42.53％.其余抗菌药物2012～2015年的耐药率有一定的波动,但总体变化不明显,2016年各抗菌药物的耐药率均明显升高.结论 我院KPN的耐药趋势有一定的波动,尤其2016年耐药情况较为严重,应引起各相关科室高度重视,临床应根据药物敏感性试验结果合理使用抗菌药物.     

Solexa测序法研究肺炎克雷伯菌质粒基因组的耐药基因

目的 通过Solexa高通量测序法研究肺炎克雷伯菌的质粒与耐药性的关系.方法 菌株为7年临床分离的206株肺炎克雷伯菌.提取所有菌的全部质粒DNA,Solexa高通量测序获得大规模的短序列.SOAP软件对质粒基因进行分析拼接,分析结果与相关数据库进行比对.MAQ软件分析质粒基因组包含的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)多样性及单核苷酸多态性(SNP)情况.结果 肺炎克雷伯菌质粒基因组中已知的直接与耐药相关的基因就有13种.质粒基因组中存在多个ABC主动外排转运系统.发现4种编码β-内酰胺酶的ORF,其中SHV型ESBLs分布最广.系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组中SHV型ESBLs的SNPs位点,发现存在着大量的非同义替换SNPs位点.结论 发现质粒中SHV型ESBLs基因可能受到选择压力,存在着大量的非同义替换SNPs位点.肺炎克雷伯菌质粒存在外排药物耐药方式,从而形成低水平的非特异多重耐药.     

肺炎克雷伯菌的喹诺酮外排基因qepA的检测及菌株同源性分析

目的 检测质粒介导的喹诺酮类外排基因qepA在临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌中的分布情况,并对阳性菌株进行同源性分析.方法 41株细菌的鉴定和药敏采用Vitek-2 Compact系统;采用PCR法检测qepA并进行序列测定、比对.应用Rep-PCR法采用Diversilab系统对qepA阳性菌株进行同源性分析;同时了解阳性株上的rmtB分布情况.结果 5株肺炎克雷伯菌上检测到qepA基因,检出率为12.2%.Diversilab分析结果表明其中两株的qepA阳性菌同源性超过99%.包含qepA的肺炎克雷伯菌中2株(40%)检出rmtB.结论 在肺炎克雷伯菌临床菌株上检出质粒介导的喹诺酮类外排基因qepA.

Abstract：

Objective To investigate the prevalence of qepA, quinolone efflux protein, among 41 unique clinical strains of K. pneumoniae producing ESBLs and to study the qepA-bearing isolates using the Diversilab system. Methods Identification and antimicrobial susceptibility were performed by Vitek-2 Compact System. Screening of qepA was carried out by PCR amplification. The NCBI BLAST program was utilized for sequence comparisons. qnr-bearing strains was evaluated by the Repetitive-sequence-based PCR(Rep-PCR) employing the Diversilab system. And the existence of rmtB was detected among these qepA contained isolates. Results qepA were detected in 5 isolates( 12.2% ). The Rep-PCR profiles produced by the Diversilab system showed that 2/5 of isolates were indistinguishable. And 60% of qepA-positive isolates were detected to harbor rmtB gene. Conclusion The data suggest the emergence of qepA-borne K. pneumoniae.     

肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究进展

喹诺酮类药物作为广谱抗菌药物,已被广泛应用于革兰阴性肺炎克雷伯菌的治疗,而肺炎克雷伯菌为了不被杀灭产生对喹诺酮耐药的分子机制成为细菌治疗研究的热点之一.本文对肺炎克雷伯耐喹诺酮的主要机制及目前的研究进展作一综述.     

肠道定植肺炎克雷伯菌临床特征和生物膜形成能力分析

目的 研究本院住院患者肺炎克雷伯菌肠道定植情况以及定植菌生物膜形成能力。方法 收集2020年1月至12月于本院住院患者的粪便标本中分离到的肺炎克雷伯菌,分析肺炎克雷伯菌的临床特点。采用VITEK-2全自动微生物分析系统检测菌株的耐药性。结晶紫染色法测定菌株的生物膜形成能力。PCR法检测生物膜相关毒力基因。结果 435例粪便标本共分离到92株肺炎克雷伯菌,定植率为21.1%。其中,碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)60株,碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)32株。定植菌的生物膜阳性率92.4%,CRKP生物膜形成能力要显著高于CSKP(P<0.05)。定植菌对生物膜相关毒力基因的携带率高,luxS、wzm、wbbm和wzc的检出率分别为97.8%、82.6%、65.2%和65.2%。结论 肠道定植菌以CRKP为主,耐药率高,生物膜阳性率高且生物膜形成能力高于CSKP。     

肺炎克雷伯杆菌在T24细胞内存活的动态观察

目的：了解肺炎克雷伯杆菌与膀胱上皮细胞的相互关系,观察肺炎克雷伯杆菌在人膀胱上皮细胞抹T24中生存的动态变化。方法：采用肺炎克雷伯杆菌临床分离抹03138侵袭T24细胞,并用庆大霉素杀死细胞外的细菌,分别于细菌进入细胞后的4、24、48及72h裂解细胞,释放出细胞内的活细菌,用平板菌落计数法计数胞内活菌数。结果：T24细胞内的肺炎克雷伯杆菌03138抹在实验48h内有一定生长,试验72h细胞内活菌数量明显减少。加入细胞因子（TNF-αd和INF-γ）可以促进上皮细胞清除胞内细菌。结论：膀胱上皮细胞清除进入细胞内的肺炎克雷伯杆菌,可能是泌尿道天然免疫的一种防御机制,而细胞因子可以调控上皮细胞的抗菌作用。     

Study of Klebsiella pneumoniae producing extendedspectrum β-lactamases against aminoglycosides

Klebsiella pneumoniae （ K. pneumoniae） is one of the main gmn-negative bacilli in clinical practice. Nosocomial infections caused by K. pneumoniae producing extended-spectrum β-lactamases （ESBLs） are very difficult to treat. This paper investigated the resistant characteristics of K. pneumoniae producing ESBLs and their aminoglycoside-modifying enzyme gene expressions including Nacetyltransferases and O-adenyltransferases. Bacteria identification and ESBLs confirmatory tests were performed by Phoenix^TM-100 system. And minimum inhibitory concentrations （MICs） of gentamicin, amikacin, kanamycin, tobranycin, netilmicin and neomycin in 53 K. pneumoniae isolates were detected by agar dilution. In addition, six aminoglycoside-modifying enzyme genes were amplified by polymerase chain reaction （PCR） and verified by DNA sequencer. It was found that imipenem and meropenem against 120 K. pneumoniae isolates produced powerful antimicrobial activities. The resistant rates of gentamicin and amikacin were 55.0% and 46.7%, respectively. Except neomycin, MIC50 and MIC90 of gentamicin, amikacin, kanamycin, tobramycin and netilmicin in 53 K. pneumoniae were all 〉 128 μg/ml, and the resistant rates were 83.0%, 52.3%, 75.5%, 81.1% and 69.8%, respectively. However, neomycin was only 39.6%. In addition, five modifying enzyme genes, including aac（3）-Ⅰ, aac（3）-Ⅱ, aac（6＇）-Ⅰb, ant（3＂）-Ⅰ, ant（2＂）-Ⅰ genes, were found in 53 isoaltes except aac （6＇）-Ⅱ, and their positive rates were 11.3%, 67.9%, 47.2%, 1.9% and 39.6%, respectively. It was also confirmed by nucleotide sequence analysis that the above resistant genes shared nearly 100% identities with GenBank published genes. The results obtained in the present study indicated that K. pneumoniae producing ESBLs strains are rapidly spreading in our hospital, and their resistance to aminoglycosides may be associated with aminoglycoside-modifying enzyme gene expressions.     

肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖经EGFR途径诱导支气管上皮细胞分泌细胞因子

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)在肺炎克雷伯杆菌(KP)荚膜多糖(CPS)诱导人正常支气管上皮BEAS-2B细胞分泌炎性细胞因子中的作用。方法:体外培养KP并提取CPS,用不同浓度的CPS刺激BEAS-2B细胞,通过ELISA检测细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)的水平,并于刺激后不同时点通过Western blot检测EGFR的磷酸化水平;EGFR抑制剂AG1478预处理BEAS-2B细胞后,Western blot检测ERK磷酸化水平,间接免疫荧光染色检测p65的核转位,并观察细胞上清中TNF-α和IL-8的变化情况;最后经ERK抑制剂PD98059和NF-κB抑制剂PDTC分别预处理后用CPS刺激细胞,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-8的水平。结果:10 mg/L CPS刺激BEAS-2B细胞12 h能够显著诱导其分泌TNF-α和IL-8;Western blot和间接免疫荧光染色检测结果显示,CPS刺激可显著诱导BEAS-2B细胞中EGFR和ERK的磷酸化及p65的核转位。经EGFR抑制剂AG1478预处理细胞后,ERK的磷酸化水平...     

克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究

目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺上皮细胞株IL8分泌的影响,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制。方法:实验分为两组,一组使用能使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理,而另一组不处理。分别用Kp03183的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激肺上皮细胞株A549,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL8表达水平。并用RT-PCR的方法检测肺上皮细胞胞内模式识别受体NOD1的表达。结果:Kp培养上清对未经digitonin处理的细胞IL8分泌无明显增强作用,与对照相比差异无显著意义(p>0.05),菌体成分能刺激IL8分泌增加(P<0.01),但增高不超过一倍。经digitonin处理使细胞膜通透性增加后,Kp培养上清及菌体成分刺激细胞IL8的作用都增强,菌体成分刺激IL8效果更为显著,为对照的3倍,而培养上清作用相对较弱。RT-PCR检测结果表明,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1。结论:菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节。肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌菌体成分,值得进一步的研究。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药基因分析

目的 了解邢台地区产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的分子流行病学特点,为临床感染预防和治疗提供依据.方法 采用最小抑菌浓度(MIC)法检测产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性,选取13种特异性引物采用聚合酶链反应(PCR)的方法检测产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因类型.结果 2013年1月至2014年3月从邢台人民医院分离出的125株非重复的产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株,耐药基因以blaCTX-M的阳性率最高,为92.0％,blaSHV和blaTEM次之,为82.9％和73.2％.所有菌株均携带1种或1种以上的耐药基因.结论 产ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐药现象严重,耐药基因以blaCTX-M、blaSHV和blaTEM为主.医院应加强对ESBLs的监测,降低ESBLs的感染率以及耐药基因的突变,提高治疗感染的效率,防止医院感染的发生.     

喹诺酮类药物对耐药肺炎克雷伯杆菌的体外抗菌活性分析

目的:了解耐喹诺酮类肺炎克雷伯杆菌的体外抗菌活性及CCCP对喹诺酮类药物体外抗菌活性的影响。方法:从99株肺炎克雷伯杆菌临床分离株中选取对环丙沙星耐药(M IC≥4μg/m l)菌株14株。采用琼脂二倍稀释法测定抗菌药的最低抑菌浓度(M IC),同时测CCCP对喹诺酮类药物M IC的影响。结果:14株肺炎克雷伯杆菌对5种喹诺酮类药物无一株敏感,且表现出较高水平的耐药。对其它抗生素的耐药率由高到低依次是氨苄西林、哌拉西林、氯霉素、庆大霉素、氨曲南、阿米卡星、头孢噻肟和头孢吡肟。亚胺培南未发现有耐药株。喹诺酮类药物与CCCP合用后,在部分菌中的M IC中出现了明显的降低。结论:耐喹诺酮类肺炎克雷伯杆菌对喹诺酮类呈交叉耐药,且呈较高水平耐药;CCCP可以明显提高部分喹诺酮类药物对肺炎克雷伯杆菌的体外抗菌活性;亚胺培南、第三代头孢菌素、氨曲南和阿米卡星对耐喹诺酮肺炎克雷伯杆菌仍有一定作用。     

质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌儿童分离株耐药基因研究

目的 研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌临床儿童分离株的耐药特点及分子流行病学特征.方法 收集温州医学院附属第二医院2010年7月-2011年6月从儿童标本中分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌12株,所有菌株为非重复菌株,菌种鉴定采用全自动微生物分析仪.改良的Hodge试验筛选产碳青霉烯酶阳性菌株,采用PCR法检测KPC、IMP、bla(s)、VIM、SPM和整合酶基因,测序确定基因型.对菌株进行质粒结合试验、质粒消除试验检测质粒的转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析耐药菌株的同源性.结果 12株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑的敏感率分别为8.3％、41.7％、58.3％、8.3％、8.3％、33.3％;12株菌均携带有KPC-2基因,且同时携带有TEM-1和SHV型β-内酰胺酶基因,其中SHV-11-like和SHV-1 2-like各6株;11株携带CTX-M型基因,其中4株为CTX-M-14-like基因,6株CTX-M-15-like基因;2株携带有OXA-10型基因,1株携带有PER-1基因.未检出NDM-1、GIM、SPM、SIM、VIM型碳青霉烯酶基因.12株均为Ⅰ类整合酶基因(int1)阳性.2株通过接合试验把质粒传递给受体菌EC600.所有接合子blaTEM-1基因阳性、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因阳性及对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和头孢噻肟耐药,接合子ESBL基因型与供菌一致.2株菌经质粒消除后对亚胺培南的MIC值均有较大程度降低,消除后KPC-2基因扩增为阴性.12株KPC-2基因阳性菌株经PFGE分成5个基因型,主要为B型和C型.结论 KPC-2型碳青霉烯酶基因已经在儿童肺炎克雷伯菌中播散,常伴随携带多种类型的ESBL基因和Ⅰ类整合酶基因,部分耐药基因可通过质粒播散.     

肺炎克雷伯杆菌分泌因子及活菌诱导人肺上皮细胞表达分泌IL-8的研究

目的 :探讨肺炎克雷伯杆菌 (Klebsiellapneumoniae ,Kp)分泌因子及活菌诱导肺上皮细胞株表达和分泌IL 8的状况。方法 :用临床分离株Kp0 3 1 1 6、Kp0 3 1 83的细菌培养上清或活菌刺激肺上皮细胞株A5 49和SPC A 1 ,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测细胞IL 8表达量。结果 :①两株Kp培养上清分别刺激A5 49或SPC A 1后 ,IL 8表达量均有显著增高 (P <0 .0 1 ) ,且随上清刺激浓度增加而上升。②两株Kp及DH5 (活菌分别与SPC A 1共孵育 2h ,用庆大霉素杀死胞外菌 ,继续孵育 2 4h后两株Kp诱导细胞IL 8表达量均显著高于DH5α(P <0 .0 1 ) ,且随细菌数 /细胞数比例增大而上升。结论 :Kp分泌因子及活菌都能够诱导肺上皮细胞IL 8表达 ,而活菌上调IL 8的效应较培育上清分泌因子更显著 ,提示肺上皮细胞在Kp感染刺激的肺部炎症反应中起重要作用。