用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的PCR（M-PCR）方法.方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、Hms、Inv基因,对164株鼠疫菌进行扩增.结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性.结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法.     

多重PCR技术检测b型流感嗜血杆菌荚膜基因

目的应用多重PCR技术研究杭州地区儿童中分离的流感嗜血杆菌b型菌株的检出率。方法以玻片凝集法的血清分型为金标准,以流感嗜血杆菌(Hi)荚膜编码基因(bexA)和b型特异性荚膜基因序列设计引物,应用多重PCR技术对流感嗜血杆菌菌株进行荚膜基因检测。结果 2001-2002年和2006-2007年分离的399株Hi临床株中,血清分型显示不可分型株297株,占74.44%,可分型株102株,占25.56%。b型仅1株,构成比0.98%。多重PCR检测显示:102株玻片凝集法可分型的菌株中,101株bex A PCR结果阳性,1株阴性;297株不定型株中2株bex A阳性。敏感度99.02%;特异度99.33%。Hib检测结果显示b型1株,占有荚膜菌株0.99%,与血清分型结果一致。结论 bex A PCR联合针对b型特异性荚膜基因的多重PCR技术,对Hib检出率100%,克服了血清分型的弊端。     

肺炎链球菌PCR分型技术的建立与应用

目的 建立肺炎链球菌血清型分型的PCR简便方法 ,初步了解肺炎链球菌血清型/群的分布状况.方法 设计合成12种肺炎链球菌血清型/群特异性引物,优化不同血清型/群引物FCR条件,并检测最佳反应浓度、灵敏性以及特异性;初步应用于肺炎链球菌菌株的血清型/群检测.结果引物浓度优化后,12种肺炎链球菌血清型/群特异引物呈现较好的特异性与敏感性;对119株肺炎链球菌菌株进行PCR分型检测,其中113株可分为9个血清型/群(3、5、6A/B、9A/V、14、18、19A、19F、23F),6株未分群.结论 初步建立了12种血清型/群肺炎链球菌PCR分型技术,可用于鉴别人群中主要流行的肺炎链球菌血清型/群.     

PCR方法快速检测猪链球菌2型的研究

目的 利用PCR方法鉴定疑似猪链球菌(S.suis)菌株,对其应用效果进行评价.方法 采用S.suis种特异性基因(16s rRNA)和荚膜多糖S.suis2型特异性基因(cps2J)引物对3株疑似S.suis菌株进行PCR扩增,并和常规培养方法进行比较.结果 PCR方法对3株疑似S.suis菌株扩增出16s rRNA和cps2J基因条带,鉴定结果为S.suis2型,与常规培养方法结果相符.结论 与常规培养方法相比,S.suis2型PCR检测方法准确、快速,适合S.suis疫情的快速检测.     

实时荧光PCR法检测b型流感嗜血杆菌

目的利用荧光定量PCR技术,建立b型流感嗜血杆菌的快速敏感特异的检测方法。方法以b型流感嗜血杆菌荚膜基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以b型流感嗜血杆菌菌株,提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和退火温度。以b型流感嗜血杆菌和8种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为800 nM、200 nM,退火温度为56℃时,具有良好的特异性和敏感性。在8株相关菌株的检测中,除b型流感嗜血杆菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限100 cfu/mL。稳定性分析表明:同一样品重复检测4次C t值的最大变异系数为5.46%。与常规方法比较,符合率达100%。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快速,具有较大的推广及应用价值。     

TapMan探针的Real-time PCR技术定量检测副溶血弧菌的临床应用

目的:用TapMan探针的Real-time PCR技术检测鉴定食品中的副溶血弧菌污染定性,并定量检测试剂盒。方法:以副溶血弧菌gyrB基因序列为依据,设计并合成TapMan探针和特异性引物,将扩增的特异片断制成阳性模板,并绘制标准曲线。结果:通过对8种细菌(10株菌株)的DNA进行扩增,发现3株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,而其它的7株非溶血弧菌均不产生扩增曲线。结论:TapMan探针的Real-time PCR技术具有很高的特异性及敏感性,能有效避免污染,值得临床广泛应用及推广。     

用套式PCR检测b型流感嗜血杆菌

为快速、准确地诊断b型流感嗜血杆菌(Hib)感染,用Hib荚膜型特异DNA3条引物,套式PCR扩增Hib,并用Hia、c～f荚膜标准菌株及4种其它细菌作对照.只有Hib标准株出现特异条带,45例肺炎患儿鼻咽深部分泌物阳性率为22.2%,23例非呼吸道感染患儿阳性率为4.3%,8例化脓性脑膜炎患儿脑脊液2份阳性.认为用PCR检测Hib,比细菌培养更快速、敏感,特异性好,能及时准确诊断Hib感染.     

荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌双重PCR检测方法的建立和临床应用

目的建立基于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,Hi)外膜蛋白P6编码基因omp6和荚膜编码基因bex A的双重PCR检测方法,并确定其检测限、灵敏度和特异度。方法根据Gen Bank公布流感嗜血杆菌的omp6和bex A基因核苷酸序列设计引物,用Hi标准菌株确定其检测限,双重PCR检测289例鼻窦炎患者鼻咽部分泌物(NPS)确定方法的灵敏度与特异度。结果 289例NPS培养阳性率为50.5%,14株为荚膜型;双重PCR检测omp6的阳性率为54.7%,bex A阳性16株。双重PCR与细菌培养及血清凝集试验符合率分别为95.8%和99.3%。检测时模板的下限为3.8 pg/μl。双重PCR检测omp6和bex A基因的灵敏度均为100.0%,特异度分别为91.6%和99.3%。结论建立的双重PCR是一种快速、特异和敏感的Hi感染的检测和分型方法,可代替细菌培养和血清凝集试验用于临床标本诊断。     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

4株荚膜型流感嗜血杆菌分型情况的比较

目的:为预防和控制Hi相关疾病提供菌株分型资料。方法:分析比较4株从5岁以下幼儿中分离的荚膜型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,Hi)的血清分型、生物分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)的结果。结果:4株荚膜型Hi中,2株Hib均为生物Ⅰ型;1株Hie为生物Ⅲ型;1株与a、f荚膜型抗血清有交叉凝集的Hia/f为生物Ⅰ型。4株PFGE型的相似度,为48.8%～58.5%,其中,2株Hib菌株之间的相似度仅为48.8%;MLST分型,2株Ⅰ型Hib同为ST-95型,1株生物Ⅲ型的Hie为ST-18型,1株生物Ⅰ型的Hia/f可能为新的ST型,等待提交验证。结论:4株荚膜型Hi彼此间遗传关联度小,提示人群中尚未形成优势荚膜型Hi的聚集。Hi当菌株生物型和血清型相同时,PFGE能较好地区分不同来源的菌株。     

2010年度卫生部全国细菌耐药监测报告:流感嗜血菌与副流感嗜血菌报告

目的 了解2010年度全国临床分离的流感嗜血菌和副流感嗜血菌对常用抗菌药物的耐药性.方法 卫生部全国细菌耐药监测网成员单位按照监测方案要求,收集临床菌株,并进行药物敏感性测试;依照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2010年标准判断敏感性;用Whonet 5.6软件处理数据.结果 2010年度全国129所医院参加监测,收集流感嗜血菌2057株,副流感嗜血菌1148株;流感嗜血菌和副流感嗜血菌对氨苄西林的耐药率为45.0％、42.5％;流感嗜血菌对喹诺酮类耐药率＜30.0％,副流感嗜血菌对喹诺酮类耐药率约为40.0％;碳青霉烯类抗菌药物对两种菌的体外抗菌活性均＞90.0％;对头孢菌素、氯霉素、阿奇霉素的耐药率均＜30.0％.结论 大多数抗菌药物对嗜血菌属仍保持良好的抗菌活性;产β-内酰胺酶是嗜血菌属对氨苄西林的主要耐药机制.     

柯萨奇病毒A6逆转录PCR检测方法的建立

目的 设计柯萨奇病毒A6（CV-A6）特异性引物,建立稳定可靠的一步法逆转录PCR检测方法。方法 针对CV-A6 VP1基因保守序列,设计特异性引物,建立和优化反应体系和扩增程序。对检测方法的敏感性、特异性进行评估,在临床标本的检测中对其可靠性进行评价。结果 设计的CV-A6特异性引物及建立的逆转录PCR检测方法可成功扩增CV-A6 VP1基因上的特定序列。当引物终浓度为0.3-3.0μM,退火温度为54-60℃时,扩增效果良好。该方法灵敏度达1.17×10²copies/μl,与其它多种肠道和非肠道病毒无假阳性反应。使用本方法从487份临床标本中检测出CV-A6阳性标本84份,扩增产物电泳条带清晰,测结果符合。结论 本研究所设计的CV-A6特异性引物及建立的逆转录PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点,在对临床标本的检测中稳定可靠。该方法为CV-A6型手足口病的监测和检验提供了新的技术手段。     

2008年深圳市健康人群流行性感冒嗜血杆菌带菌状况调查

目的了解深圳市健康人群流行性感冒嗜血杆菌（Haemophilus influenzae,Hi）带菌状况。方法采用随机整群抽样的方法,对深圳市380名〉1月龄健康人采集咽试子,菌株培养与鉴定参照美国《临床微生物手册》。菌株的生物学分型和血清学分型分别参照Kilian和Pittman分类法。应用聚合酶链反应对所有的菌株进行荚膜鉴定和血清学分型鉴定。结果深圳市健康人群Hi携带率为31.84%。其中6～12岁带菌率最高（54.90%）,〉50岁最低（8.51%）,各年龄组带菌率的差异有统计学意义（χ2=30.172,P〈0.005）。分离的菌株以无荚膜的不可分型Hi为主（97.14%）,有荚膜菌株占2.86%;2株为b型,3株为e型。139株Hi分为8个生物型,I～Ⅷ型分别占7.91%、37.41%、34.53%、4.32%、7.91%、0.72%、6.48%、0.72%。Hi产青霉素酶的阳性率为14.38%。结论深圳市健康人群Hi平均携带率为31.84%,儿童组携带率高于其他年龄组,菌株多为无荚膜的不可分型Hi,生物学分型以Ⅱ、Ⅲ型为主。     

Incidence and spread of Haemophilus influenzae on an Antarctic base determined using the polymerase chain reaction.

A PCR-based method of detecting Haemophilus influenzae in cultures inoculated from throat swabs was evaluated using samples from groups of laboratory staff and medical students and then applied to samples originating from the closed human community of an Antarctic research station. Suitable PCR primers to an H. influenzae gene (ompP2) were used to amplify the gene from DNA preparations made from mixed growth on chocolate agar with added vancomycin. PCR product was reamplified and subjected to restriction endonuclease digestion to allow temporal and spatial mapping of strains over an 8-month period. Eleven different strains of H. influenzae were detected. One particular strain was detected in a third of the base members.     

Risk factors for otitis media and carriage of multiple strains of Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae

We studied genetic diversity in Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae in throat culture isolates from 38 children attending two day-care centers in Michigan. Culture specimens were collected weekly; 184 S. pneumoniae and 418 H. influenzae were isolated from the cultures. Pulsed-field gel electrophoresis identified 29 patterns among the S. pneumoniae isolates and 87 among the H. influenzae isolates. Of the cultures, 5% contained multiple genetic types of S. pneumoniae, and 43% contained multiple types of H. influenzae. Carriage of multiple H. influenzae isolates, which was associated with exposure to smoking, history of allergies, and age 36 to 47 months, may increase risk for otitis media in children.     

实时荧光定量PCR快速检测大肠埃希菌的方法研究

目的基于TaqMan探针建立产肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法。方法针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素STI、不耐热性肠毒素LTI基因片段设计引物、探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行荧光定量PCR检测。结果引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应1DNA拷贝,特异性强,检测范围在100～107拷贝每反应,重复性及稳定性好,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出产肠毒素大肠埃希菌。     

Epidemiology of invasive Haemophilus influenzae infections in England and Wales in the pre-vaccination era (1990-2).

This survey defined the pattern of invasive Haemophilus influenzae infections during 1990-2 in six regions in England and Wales during the pre-vaccination era providing a baseline against which any changes in patterns of disease due to the introduction of the Haemophilus influenzae type b vaccination programme can be monitored. A total of 946 cases of invasive Haemophilus influenzae were recorded during the survey period of which almost 90% were due to type b and most of the remainder were non-typeable. Type b infections occurred predominantly in children less than 5 years of age (88%) with the highest attack rate in male infants in the 6-11 month age group. Diagnostic category varied with both age and serotype; meningitis was the commonest presentation overall but pneumonia and bacteraemia were more common in adults and non-typeable isolates. Mortality was highest in neonates and the elderly (over 65 years of age) who were more likely to have an underlying predisposing condition than older children and adults. Children under 5 years of age had a higher case fatality rate for non-typeable than for type b infections. Ampicillin resistance was 15% and there were no cefotaxime resistant type b isolates.     

基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究

目的：应用PCR技术来实现绿脓杆菌的快速鉴定。方法：绿脓杆菌特异性的PCR扩增引物是根据已报道的ETA基因序列设计的，同时考察该PCR方法的特异性和敏感性。另外，一种不提取基因组DNA而直接制备简易模板的直接PCR方法在本研究中也被尝试。结果：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，仅在包含绿脓杆菌基因组DNA的样品中得到单一条带。直接PCR方法也成功扩增出同样的条带，而整个过程在4h内完成。结论：这种扩增绿脓杆菌ETA基因的直接PCR方法对绿脓杆菌的鉴定来说是一种快速、特异、敏感和相对简单的方法。     

安徽省新型布尼亚病毒基因测序鉴定方法的建立

目的建立发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒基因测序鉴定方法,对安徽省在2011年从病人血清中分离到的10株疑似发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒进行基因测序鉴定,并分析其序列特征。方法设计引物,RT-PCR法扩增病毒核酸,对扩增产物进行测序分析。结果设计的三对引物可有效扩增核酸序列,10株疑似发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒L、M、S三段基因序列和2010年我国发现毒株序列相似性93%以上,10株病毒和Phlebovirus AH12、Phlebovirus HN6两株病毒同属于一个进化分支,和白蛉病毒属的其它病毒株不在一个分枝上。结论 2011年从病人血清中分离到的10株病毒为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒,应加强安徽省对该病的监测,有效预防大范围传播。     

Epidemiologic profile of Haemophilus influenzae infection in Tunisia

Haemophilus influenzae, a commensal bacteria, is frequently incriminated in broncho--pulmonary surinfections and severe diseases as meningitis, pneumonia and septic arthritis, particularly in young children. A multicenter study was conducted to establish the epidemiological profile of Haemophilus influenzae diseases, to determine the rate of antibiotics resistance for guide therapeutic and preventive strategies. The identification was based on the requirements for X and V factors, and the serotype b determined by agglutination. The betalactamase production was done by nitrocefin test. Antimicrobial susceptibility testing was determined on Muller Hinton chocolate agar with isovitalex. During the two year period, (January 1998 December 1999), 192 isolates of H. Influenzae were collected, 61% were recovered from invasive infections (44 meningitis, 8 bacteremia, 2 arthritis). The serotype b was identified in 55.7% of cases, 67.3% were invasive strains. 24.5% of isolates were producing betalactamase particularly invasive serotype b strains. All isolates of H. influenzae were susceptible to cefotaxim and to ofloxacin. Resistance rates to other antibiotics were: erythromycin 56.2%, tetracyclin 10.3%, rifampin 12%, chloramphénicol 1%, cotrimoxazole 16.5%, 11.5% amikacin and 20% gentamicin. The incidence of meningitis remained frequent in our country, involving the introduction of the vaccination in official calendar. Nevertheless, the surveillance of H. influenzae invasives infections and the serotyping of isolates were necessary to evaluate the impact of the immunization.