成年大鼠破骨细胞体外增减及细胞凋亡的观察

目的 为研究骨重建过程中破骨细胞的关键作用，建立成年大鼠（１２～５０周龄）破骨细胞的体外培养方法并进行细胞凋亡观察。方法 大鼠处死后，在无菌条件下取出股骨，剪去两骺端，以αＭＥＭ将骨髓细胞冲洗出。并离心洗细胞２次，置于αＭＥＭ培养液，内含αＭＥＭ，体积分数为１０％的胎牛血清（ＦＣＳ）和１α，２５－（ＯＨ）２ＶｉｔＤ３ １０＾－８ｍｏｌ／Ｌ，在２４孔板内，以体积分数为５％的ＣＯ２、３７℃，培养８天。     

分离培养骨巨细胞瘤破骨样细胞的方法学研究

本文通过组织块贴壁法、机械分离法和酶消化法对骨巨细胞瘤的破骨样细胞进行分离、培养。通过比较,结果显示：酶消化法提纯程度最高,收获量较多;机械分离法居中,但操作简单,对原位杂交、免疫组织化学和骨吸收功能检测具有一定的应用价值;组织块培养法需要时间长,各细胞成分混杂,对研究各细胞成分之间的关系,有一定帮助     

氟化钠对骨组织主要细胞类型的影响

目的明确氟化钠对骨组织3种细胞的活性作用特点。方法探究暴露于不同氟化钠浓度下的3种骨组织主要细胞活性的变化。小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)作为成骨细胞祖细胞,通过含有地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的矿化培养基诱导为成骨细胞。RAW264.7细胞利用RANKL诱导其成为破骨细胞,而IDG-SW3细胞经过矿化诱导成为骨细胞。收集对数生长期的成骨细胞、破骨细胞和骨细胞,传至96孔板,施加给8个氟浓度梯度进行处理,包括对照组、低氟浓度(0.1、0.5、1、2 mg/L)、中氟浓度(4、8 mg/L)、高氟浓度(16、32 mg/L)9个实验组。3种细胞分别经氟处理1、2、4 d后,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活性。结果染氟2 d后,0.5 mg/L和1 mg/L氟显著提高了骨细胞的活性,但8～32 mg/L氟均显著抑制了破骨细胞和成骨细胞的活性。染氟4 d后,骨细胞的活性在0.1～2 mg/L氟处理下显著增高,1～4 mg/L氟处理下的破骨细胞的活性也明显比对照组高;高剂量氟16 mg/L处理下,骨细胞活性下降了8.6%,而破骨细胞和成骨细胞活性则下降了90.8%和97.2%。结论氟对成骨细胞的刺激作用范围最窄,而抑制作用显著,破骨细胞对氟剂量的变化最敏感,而骨细胞对氟化物蓄积毒性的耐受性最强。     

源于脾细胞的破骨细胞样细胞体外培养及其对成骨细胞的影响

目的探讨破骨细胞及其亚细胞结构对成骨细胞生长的影响。方法C57雌性小鼠,经尾静脉注射5-FU后,取其脾脏细胞,在白介素(IL)-3,6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、1α,25-(OH)2D3的诱导下获得大量的破骨样细胞(OLC)。将破骨样细胞、NaF、离心去除OLC的培养基及其亚细胞结构——细胞核、线粒体与成骨细胞共培养5d后,检测成骨细胞增殖率和碱性磷酸酶含量以及成骨细胞Cbfα1的表达活性。结果OLC及离心去除OLC的50%培养基均可使成骨细胞增殖率显著增加(P<0.05)。NaF、OLC、OLC细胞核和离心去除OLC的25%培养基均可使成骨细胞的碱性磷酸酶活性增高(P<0.05);离心去除OLC的培养基对成骨细胞的碱性磷酸酶比活性具有显著的促进作用(P<0.05)。NaF、OLC细胞质和离心去除OLC的50%培养基均可使成骨细胞的Cbfα1的表达明显加强(P<0.05)。结论OLC对成骨细胞的生长和功能均有促进作用。     

特异性阻断诱导培养的大鼠破骨样细胞Atp6i基因的表达

目的 筛选具有高效、高特异性地阻断体外诱导培养的大鼠破骨样细胞（osteoclast-like cells,OCL）Atp6i基因转录产物mRNA翻译过程的siRNA序列.方法 根据大鼠Atp6i基因序列设计2对siRNAs（Ⅰ、Ⅱ）序列,转染到各组体外培养第6天的OCL细胞内,转染组（Ⅰ或者ⅡsiRNA）T1组、阴性对照转染组（ⅢsiRNA）T2组、转染试剂转染组T3组以及空白对照组T4组;转染第24小时后,RT-PCR分析Atp6i mRNA的表达情况.结果Ⅰ号siRNA转染后,T1组中Atp6i基因RT-CR扩增产物密度值较其他组减少,差异明显（P＜0.01）,相对密度值较其他组也明显减少（P＜0.01）.结论 Ⅰ号siRNA片段特异性的抑制大鼠OCL Atp6i mRNA表达.     

柚皮苷对破骨细胞凋亡的影响

[目的]探讨不同浓度柚皮苷单体对破骨细胞的凋亡的影响及相关机制.[方法]采用100 ng/ml浓度RANKL诱导小鼠单核细胞RAW264.7细胞株获取破骨细胞,之后采用含有不同浓度柚皮苷培养基对破骨细胞进行干预3d.行TRAP染色,扫描电镜观察骨薄片上骨吸收,流式细胞仪检测破骨细胞凋亡,荧光定量PCR检测破骨细胞凋亡基...     

阿司匹林对大鼠破骨细胞分化成熟和骨吸收活性的影响

目的 研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞(Osteoclast,OC)分化成熟及骨吸收活性的影响.方法 建立由核激活因子受体配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)共同作用的大鼠破骨细胞骨髓诱导体系,将雌激素(10-6 mmol/L)和不同浓度的阿司匹林(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L)分别作用于破骨细胞.诱导培养后分别对破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(The tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色,观察细胞形态,并计数破骨样细胞数量;将各组破骨细胞接种于骨磨片上,建立破骨细胞-骨磨片活性分析模型,于不同时间点对骨磨片进行光镜和扫描电镜观察,分析计算骨吸收陷窝面积.结果 与正常对照组相比,雌激素组破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积低于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);且随着阿司匹林浓度的增加,阿司匹林组TRAP阳性多核破骨细胞数量、骨吸收陷窝面积逐渐减少直至消失,差异有统计学意义(P＜0.05).与雌激素组相比,低浓度阿司匹林组(0.25mmol/L)没有明显差异;但中、高浓度阿司匹林实验组(0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L)破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 阿司匹林对破骨细胞的分化成熟及骨吸收功能有抑制作用,且呈剂量依赖性,从而具有抗骨质疏松的作用.     

人成骨样细胞和前破骨样细胞ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的研究

目的分析比较两种人成骨样细胞系(U2-OS、MG-63)和两种人前破骨样细胞系(U937、HL-60)ER亚型、OPG/RANKL/RANK系统、IL-6及其受体以及破骨细胞标志基因表达的差异,为今后研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系提供适宜的细胞模型。方法RT-PCR和免疫印迹法检测ERα、ERβ的表达,ELISA法测定IL-6的分泌,OPG、RANKL、RANK及IL-6受体的表达采用免疫印迹法进行检测,TRAP、MMP-9则采用RT-PCR技术进行分析。结果(1)转录水平及蛋白水平证实四种细胞均表达ERα和ERβ;(2)四种细胞不同程度地表达OPG和RANKL,而RANK则仅见于U937细胞表达;(3)四种细胞均表达IL-6受体(IL-6Rα、gp130),除U2-OS细胞外其余三种细胞均组成型分泌IL-6;(4)破骨细胞标志基因TRAP在两种人前破骨样细胞U937、HL-60中均表达,且表达水平相近;而MMP-9仅在U937细胞中弱表达;两种人成骨样细胞U2-OS、MG-63未见有这两种基因表达。结论筛选出用于研究雌激素与IL-6等细胞因子在骨组织中相互关系的细胞模型,同时也为今后深入阐明骨靶向和其他新型抗骨质疏松雌激素的分子机制研究奠定基础。     

细胞凋亡与骨质疏松关系的研究进展

骨质疏松症是以骨量减少、骨显微结构改变以及骨生物力学性能下降为特征的疾病。老龄化、肢体废用、女性绝经后以及糖皮质激素应用过量均可导致该病的发生,而最终原因都与骨重建失调有关。骨重建涉及骨形成与骨吸收两个方面,骨吸收－形成动态偶联的失调可引起骨形成的减少或骨吸收的增加,最终导致净骨量的减少和骨质疏松症的发生。参与骨重建的细胞包括成骨细胞和破骨细胞,它们的生物学活性及存活时间直接影响着骨转换的动态平衡。大部分细胞的死亡是以凋亡 (apoptosis)的形式完成。凋亡是由于内外环境激发所致细胞自身主动、有序的死亡…     

氟化钠及其拮抗剂硫酸锌对成骨细胞的影响

目的观察不同剂量氟化钠（ＮａＦ）对成骨细胞的影响及硫酸锌（ＺｎＳＯ４）的拮抗作用,为临床治疗提供实验依据。方法取新生２４ｈＳＤ鼠头盖骨分离成骨细胞,在不同浓度的ＮａＦ和／或ＺｎＳＯ４（１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ）中培养。经ＭＴＴ法测定细胞增殖,细胞分化由碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素水平测定得到。结果ＮａＦ对成骨细胞增殖及分化呈双向调节,主要表现为大剂量抑制,小剂量促进。当ＮａＦ浓度为１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ     

氟化钠对人黄韧带细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素合成的影响

目的 探讨氟化钠(NaF)对体外培养条件下人黄韧带细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及骨钙素(bone gla protein,BGP)合成的影响.方法 依据手术标本来源不同,分为正常黄韧带细胞(NLF)组(取自急性外伤性胸腰椎骨折截瘫患者,7例)、退变黄韧带细胞(DLF)组(取自退变性腰椎管狭窄症患者,9例)及骨化黄韧带细胞(OLF)组(取自胸椎黄韧带骨化患者,8例).采用组织块贴壁法进行体外细胞培养,共获得24组传代细胞.取第五代细胞加入不同浓度的NaF,观察细胞形态变化,并测定NaF对各组人黄韧带细胞的ALP活性和BGP合成的影响.结果 不同来源的人黄韧带细胞均可在体外增殖并传代,DLF与OLF组人黄韧带细胞呈多形性表现,并可形成钙结节.体外培养条件下,高浓度(1.0mmol/L)NaF可导致人黄韧带细胞发生中毒反应;低浓度(0.01～0.125 mmol/L)NaF可促进DLF组黄韧带细胞增殖、钙结节形成,ALP活性上调,BGP合成明显增加,而对OLF与NLF组人黄韧带细胞则无明显效应.结论 体外培养条件下,低浓度(0.01～0.125 mmol/L)NaF可促进人退变黄韧带细胞的ALP活性增高及BGP合成增加,提示低浓度NaF可能促进人退变黄韧带细胞向成骨方向分化.     

正常和双侧卵巢切除大鼠体外骨髓培养破骨细胞凋亡变化的研究

目的观察正常和双侧卵巢切除(Ovariectomized,OVX)大鼠体外骨髓破骨细胞样细胞(Osteoclastic like cell,OLC)凋亡变化。方法24只Wistar大鼠,分别在术后2 w、1、2、3、5和6个月取大鼠骨髓,24孔培养板上培养7 d后观察OLC凋亡变化。结果 OVX大鼠体外OLC凋亡百分数明显低于正常对照组(P<0.05)。结论 OVX大鼠因雌激素明显降低,破骨细胞凋亡减少,骨吸收增加,导致骨质疏松发生。     

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的研究

目的观察血管形成抑制剂3TSR体内外对内皮细胞的影响，并探讨与细胞凋亡蛋白酶．3（Caspase-3）的关系。方法在体外培养条件下比较对照组、不同剂量3TSR（1—3μmol／L）作用48h对人脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响，并用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组Caspase-3 mRNA转录水平。建立裸鼠原位胰腺癌模型，进行随机干预实验，比较对照组（每日0．2ml生理盐水腹腔注射）、3TSR1组（每日1mg／kg体重腹腔注射）、3TSR2组（每日2mg／kg体重腹腔注射）及3TSR3组（每日3mg／kg体重腹腔注射），每组6只，3周后检测胰腺癌原位肿瘤血管内皮细胞凋亡率。结果体外培养时3TSR对人脐静脉内皮细胞有显著增殖抑制及凋亡诱导作用，作用48h后其凋亡率分别为（10．3±3．2）％，（12．4±4．1）％和（20．1±5．4）％，均显著高于对照组（P〈0．05）。3TSR1组、3TSR2组和3TSR3组Caspase-3 mRNA转录水平相对强度分别（0．76±0．11），（0．79±0．21）和（0．89±0．19），均显著高于对照组（P〈0．05），且随浓度增加而增强。体内实验时3TSR能显著诱导胰腺癌血管内皮细胞凋亡，3TSR1组、3TSR2组及3TSR3组凋亡率分别为（7．8±3．0）％，（14．6±4．9）％和（15．9±3．2）％，均显著高于对照组（P〈0．05）。结论3TSR体内外均能诱导内皮细胞的凋亡，且呈一定的浓度依赖性，其作用机制可能与促进Caspase-3基因转录有关。     

Relationship between bone fluoride content and histological evidence of calcification defects in osteoporotic women treated long term with sodium fluoride

Fluoride treatment is used to increase bone formation and cancellous bone mass in patients suffering from postmenopausal osteoporosis with vertebral fractures. Patients submitted to similar therapeutic protocols have shown various histological responses to the treatment, some developing calcification defects and others not. In fact, the bone histological response to fluoride salts depends on the cumulative uptake of fluoride by bone. To clarify the relationship between the presence of calcification defects (identified by the presence of mottled bone and linear formation defects) and the bone fluoride content, a retrospective study was performed on 29 women with type 1 osteoporosis and treated for several months (11–24) with sodium fluoride (50 mg/day), calcium and vitamin D. Bone fluoride content always significantly increased after treatment, but it was significantly higher in patients showing calcification defects than in those having no defects. These differences between the two groups of patients were not due to differences in clinical details (no significant differences concerning age, duration of treatment, total amount of fluoride ingested, renal function) or in their bone remodelling activity. Thus, it may be hypothesized that the high bone fluoride uptake is due to different individual responses from one patient to another concerning the bioavailability of the same dose of fluoride. This is difficult to predict, except by testing the individual bioavailability of the compound to be used in each patient before starting long-term treatment.     

Influence of food and antacid administration on fluoride bioavailability from enteric-coated sodium fluoride tablets

The relative bioavailability of enteric-coated sodium fluoride (NaF) tablets (10 mg F⁻) has been assessed following administration with a standard calcium-rich breakfast or calcium-poor lunch, and 2 h before or simultaneously with antacid administration (2.4 g aluminum-magnesium hydroxide), versus intake on an empty stomach. Twelve volunteers were studied 3 times according to an open, three-way crossover design over a 24 h period at weekly intervals. Meals were found to decrease the peak serum concentration of NaF from 122 μg/L during fasting (after baseline subtraction) to 71 and 88 μg/L with breakfast and lunch respectively, and to slow its absorption rate with Tmax increasing from 3.3 to 7.3 and 11.2 hours, without altering its bioavailability. Antacid impaired the bioavailability of NaF by 80% when administered simultaneously, with AUC decreasing from 987 to 155 μg.h/ L, but had no significant effect when taken 2 h before NaF. In conclusion, the enteric-coated NaF tablets used in this study can be administered with food or after a 2-hour delay following antacid administration, but should not be taken simultaneously with antacid.     

大鼠隐睾生殖细胞发育和凋亡与eNOS蛋白与mRNA表达

目的　探讨内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)蛋白及其mRNA表达与实验性大鼠隐睾生殖细胞发育和凋亡的关系。　方法　采用生物素 dUTP/酶标亲和素测定法检测SD大鼠单侧隐睾模型睾丸生殖细胞凋亡 ,免疫组化方法检测大鼠睾丸生殖细胞中eNOS基因表达 ,原位杂交法检测大鼠生殖细胞中eNOSmRNA的表达。　结果　术后第 7天隐睾侧睾丸发生凋亡的生殖细胞数与对侧正常睾丸相比显著增加 (P <0 .0 1)。术后第 4 0天 ,对侧正常睾丸的精子细胞中可见eNOS基因表达。术后第 3、7天 ,隐睾侧睾丸生殖细胞中eNOSmRNA表达与对侧正常睾丸相比无明显变化 (P >0 .0 5 )。　结论　在大鼠青春前期 ,eNOS基因表达与雄激素生成和生殖细胞发育有关 ;在成年期 ,eNOS基因表达可能仅与精子的成熟及活力有关而与生殖细胞凋亡无关。     

醛固酮对肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的 研究醛固酮（Ald）对大鼠肾小球系膜细胞（MC）凋亡的影响并探讨其可能机制。 方法 24只SPF级SD大鼠,腹腔埋置渗透性微泵,随机分为对照组（Con组,生理盐水代替Ald处理28 d;n=8）、Ald输注组（Ald组,1.5 μg/h,28 d;n=8）、依普利酮干预组（Epl组,Ald 1.5 μg/h+依普利酮 100 mg&#8226;kg-1&#8226;d-1,28 d;n=8）。药物处理0 d、7 d、14 d、21 d、28 d时,分别测量大鼠尾动脉收缩压并收集24 h尿液,测定尿白蛋白排泄率（UAER）;于28 d时心脏采血并分离大鼠双侧肾脏,检测血肌酐、血钾及血Ald水平;PAS染色观察肾小球病理改变;TUNEL法检测MC凋亡。体外培养大鼠MC,Annexin V-PI双染流式细胞仪检测MC凋亡;实时定量PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达,Western印迹检测Bad磷酸化水平。 结果 Ald组大鼠血压及UAER自7 d时起显著高于同期Con组（P < 0.05）,28 d时Ald组大鼠血浆Ald水平约为Con组的6倍（P < 0.05）,血钾显著低于Con组（P < 0.05）,血肌酐与Con组差异无统计学意义（P > 0.05）。PAS染色显示Ald组大鼠肾小球系膜区增宽,基质增多,部分出现节段硬化。TUNEL检测发现,Ald组大鼠MC凋亡显著高于Con组及Epl组（均P < 0.05）。体外实验发现,随着Ald作用时间的延长,MC凋亡数明显增加（P < 0.05）;Ald组Bcl-2 mRNA表达下降（P < 0.05）,Bax mRNA表达升高（P < 0.05）;Ald组Bad蛋白磷酸化水平显著低于Con组（P < 0.05）。依普利酮能显著逆转Ald诱导的上述作用。 结论 Ald能促进大鼠MC凋亡,依普利酮干预可以明显降低Ald的促凋亡效应。Bad蛋白的去磷酸化作用可能是Ald致MC凋亡过程中的重要环节。     

NGAL对大鼠肾脏缺血再灌注损伤时肾小管上皮细胞凋亡的保护作用

目的探讨中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL）对大鼠肾脏缺血再灌注损伤肾小管上皮细胞凋亡及凋亡蛋白fas,bcl-2表达的影响。方法建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,用HE染色观察肾组织病理变化情况;TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡;免疫组织化学方法检测fas,bcl-2蛋白表达,并利用图像分析系统测量阳性表达率进行定量分析。结果①缺血再灌注模型组肾小管上皮细胞凋亡数为（20．8±3．7）个／高倍视野,NGAL组为（8．6±3．4）个／高倍视野,2组差异有统计学意义（P〈0．05）。②NGAL组较缺血再灌注模型组fas阳性表达率下降,差异有统计学意义（P〈0．05）;bcl-2阳性表达率增强,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NGAL对大鼠缺血再灌注损伤的肾小管上皮细胞有保护作用,其作用可能与减少细胞凋亡、改变凋亡蛋白的表达有关系。     

丙戊酸钠对胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响及机制

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对胰腺癌细胞株SW1990增殖、凋亡的影响,探讨丙戊酸钠诱导SW1990凋亡的机制.方法 应用1、2、3、4、5 mmol/L的丙戊酸钠干预SW1990细胞,以未干预的细胞作为对照组.采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;取3 mmol/L丙戊酸钠干预SW1990细胞24、48、72 h,流式细胞仪检测细胞凋亡;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测SurvivinmRNA的表达.结果 丙戊酸钠对SW1990细胞有明显的生长抑制作用,呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性,不同浓度组、不同时间组间生长抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).3 mmol/L丙戊酸钠干预SW1990细胞不同时间的凋亡率分别为(15.79 ±2.18)％、(26.73±2.36)％、(38.74±1.83)％,与对照组早期凋亡率[(2.99±0.87)％]比较,不同时间比较差异有统计学意义(P＜0.05).未经丙戊酸钠干预的SW1990细胞高表达Survivin基因(5.152±1.835),在经3 mmol/L丙戊酸钠干预24、48、72 h后,Survivin基因的表达水平分别为3.977±1.531、2.639±1.017、1.034±0.239,随药物干预时间的延长Survivin基因的表达水平逐渐下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 丙戊酸钠可抑制胰腺癌细胞SW1990的增殖、诱导凋亡,其机制可能与激活线粒体内源性凋亡途径,下调Survivin基因有关.