外源性Nurr1基因过表达对SK-N-SH细胞分化作用的研究

为研究外源性Nurr1基因过表达对转染细胞的作用,探讨Nurr1基因调控多巴胺能神经元分化的机制。本研究应用:(1)pBK- RSV -Nurr1质粒经脂质体法转染SK- N- SH细胞,G418筛选;用RT PCR和免疫细胞化学方法检测基因转染细胞Nurr1mRNA及Nurr1蛋白的表达; (2)all- trans- RA、9- cis- RA、forskolin诱导基因转染细胞,RT PCR及免疫荧光细胞化学方法检测基因转染细胞MAP2 和TH的表达。结果显示: (1)经RT -PCR检测,基因转染细胞表达Nurr1mRNA;免疫细胞化学染色结果显示基因转染细胞表达Nurr1蛋白,说明外源性Nurr1基因在转染细胞内过表达;基因转染细胞形态与正常细胞相比没有明显变化,生长速度略有降低并表达成熟神经元的特异性标识物MAP2,但不表达多巴胺能神经元的特异性标识物TH。(2)尽管RA、forskolin诱导可促进Nurr1基因转染的SK- N- SH细胞进一步向成熟神经元分化,但不能诱导基因转染细胞表达TH。结论:单纯的Nurr1过表达可以促进SK- N- SH细胞向成熟神经元方向分化,但不足以激活TH基因转录。TH基因的转录激活还需要除Nurr1以外的其它细胞(或神经元)的环境或因子的共同作用。     

α-Synuclein磷酸化修饰提高MN9D细胞内TH的活性

目的观察突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)第129位丝氨酸(Ser129)磷酸化修饰对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)活性的影响。方法应用重叠延伸PCR定点突变法将129位丝氨酸编码碱基TCT突变为天冬氨酸(Asp,D)编码碱基GAT,获得编码模拟磷酸化α-Syn(S129D α-SYN)的DNA序列,插入逆转录病毒真核表达载体(pLNCX2)。包装逆转录病毒颗粒并感染多巴胺能神经细胞MN9D。通过实时定量RT-PCR鉴定α-SYN基因表达,Western blot检测TH磷酸化水平。结果pLNCX2-α-SYN(wild type/S129D)质粒测序结果正确,并在MN9D细胞中均过表达。野生型α-SYN过表达组同正常对照组相比TH磷酸化水平降低(P<0.01),而S129D α-SYN组TH的磷酸化水平同正常对照组相比明显升高(P<0.05)。结论在MN9D细胞中,野生型α-SYN抑制TH的活性,而α-SYN Ser129磷酸化后TH活性明显升高。     

α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的　研究α-突触核蛋白(α-SYN) 129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法　应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN (WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN (S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响。 结果　实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达（P<0.01）。WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降（P<0.01）,共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高（P<0.01）。结论　129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性。     

帕金森病模型大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白表达增加

目的 观察鱼藤酮对大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白(α-SYN)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响.方法 利用脑立体定位技术注射微量鱼藤酮,建立急性损伤帕金森病(PD)模型.采用动物行为轨迹分析软件计算各时间点30 min内运动距离和平均运动速度.免疫组织化学检测黑质(SN)部位TH、磷酸化α-SYN的表达,并统计TH和磷酸化α-SYN阳性神经元数目.结果 PD组动物各时间点30 min内运动距离、平均运动速度低于对照组(P＜0.05,0.01).同对照组相比,损伤侧SN部位TH阳性神经元数目明显减少(P＜0.01),磷酸化α-SYN阳性神经元数目明显增加(P＜0.01).结论 PD大鼠中脑黑质磷酸化α-SYN表达增加及TH的表达明显下降,并出现运动障碍.     

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

P>核受体相关因子1基因过表达诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元/P>

目的 探讨核受体相关因子1（Nurr1）基因对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法 通过基因重组技术构建pEGFP-N1-Nurr1真核表达载体,用电穿孔法将重组质粒转染第3代NSCs,用荧光显微镜观察转染效率,免疫印迹法检测基因表达效果;并对转染后的NSCs进行体外分化培养3周,用免疫荧光双标技术检测酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。结果电穿孔法转染NSCs 48h后转染效率达35%,1周后免疫印迹法检测到Nurr1蛋白高表达,约为对照组的5倍;Nurr1基因转染的NSCs分化为TH阳性神经元的比率为15.45%,明显高于对照组,而MAP-2阳性神经元数量与对照组相似。结论Nurr1基因过表达可以诱导NSCs向TH阳性的多巴胺能神经元分化。     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体I活性

目的研究α-突触核蛋白（α-SYN）在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体I活性的影响。方法用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α—SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运；通过观察340nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体I的活性。结果线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后，以剂量依赖的方式转运到线粒体内。将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后，线粒体复合体I活性下降，并且呈明显的量．效关系。结论线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。线粒体的α—SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运，并调节复合体I的活性。     

STCH对多巴胺能神经元保护作用的初步研究

本文通过不同手段探讨了STCH(stress and chaperone)对多巴胺能神经元的作用。采用RT-PCR检测STCH的组织表达模式;采用免疫-激光捕获显微切割技术获得单一多巴胺能神经元,采用RT-PCR检测STCH在中脑不同亚区多巴胺能神经元的表达差异;分别构建STCH过表达pEGFP-N2载体和pSuper-EGFP干扰载体,转染HEK293和SH-SY5Y细胞株,检测细胞对MPP+毒性的反应。结果显示:STCH在海马表达最低,肝脏最高;在中央灰质区的多巴胺能神经元可检测到表达,在黑质区检测不到;将STCH干扰片段转染至HEK293细胞,细胞死亡明显;转染至SH-SY5Y细胞,对细胞生长无明显影响,但细胞形态发生改变;与对照组相比过表达STCH的SH-SY5Y细胞对MPP+毒性有抵抗作用,并能抑制MPP+处理细胞中caspase-12的表达。这些结果提示:STCH对多巴胺能神经元具有潜在的保护作用,其机制可能是通过抑制内质网应激诱导的凋亡途径而实现。该结果为寻找Parkinson病的治疗靶向提供了有益的线索。     

-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶基因-495~+25区调节活性

α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)的生理功能尚不清楚,近年研究表明,α-SYN与帕金森病(Parkinson's disease,PD)的发生发展密切相关[1].最近的研究显示,在α-SYN过表达的细胞系,酪氨酸羟化酶(ty6rosine hydroxylase,TH)的表达显著减少[2],提示α-SYN的功能与多巴胺代谢密切相关.     

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨 Parkinson病患者多巴胺能神经元变性缺失机制提供依据     

μ、κ、δ阿片受体及酪氨酸羟化酶在MN9D细胞中的表达

目的:检测多巴胺能性MN9D细胞中是否存在μ、κ、δ 3种阿片类受体及多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达,为建立吗啡依赖MN9D细胞模型奠定基础.方法:培养MN9D细胞后,采用免疫荧光标记观察μ、κ、δ3种受体蛋白表达状态;RT-PCR检测μ、κ、δ3种阿片类受体的mRNA表达;TH免疫荧光标记,观察多巴胺能神经元的表达数量.结果:免疫荧光及PCR结果均显示MN9D细胞中存在μ、κ、δ 3种受体,并且TH阳性细胞的数目明显多于多巴胺能SH-SY5Y细胞系.结论:MN9D细胞中同时存在μ、κ、δ3种阿片受体,可作为吗啡依赖细胞模型使用.     

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的 探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响.方法 应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型.将PD大鼠随机分为3组,每组8只.假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1 基因的NSCs进行移植.细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达.移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P＞0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个.结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能.     

α-突触核蛋白在大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的 研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠脑神经元的亚细胞分布.方法 利用2种新的识别不同表位的抗α-SYN单克隆抗体2E3和3D5,应用免疫组织化学、免疫荧光标记和Western blot分析法对α-SYN在大鼠脑神经元的分布进行观察.结果 2E3单抗检测到α-SYN主要存在于神经元的突触前终末;3D5单抗除了能够检测到突触前终末的α-SYNCh,还可以检测到α-SYN在神经细胞核的大量存在.Western blot分析表明,2种抗体在胞质和核组分中均可以检测到一个19 ku的蛋白,与α-SYN的表观分子质量一致.结论 α-SYN免疫活性物质不仅存在于脑神经元的突触前神经末梢,而且也存在于核中,但识别不同表位的抗体对不同亚细胞部位的α-SYN的结合能力不同.     

坍塌反应调节蛋白5促进海马神经元突起生长

目的 探讨坍塌反应调节蛋白5(CRMP5)对神经元突起生长的作用。方法 构建CRMP5真核表达载体,采用基因转染、实时定量PCR和免疫印迹技术评估CRMP5基因表达;以空载体为对照组,设3个复孔,用时差成像技术和突起提取技术观察和检测原代培养海马神经元突起的生长。结果 成功构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签蛋白的CRMP5的真核表达载体。脂质体转染技术可成功把CRMP5基因导入细胞,转染的细胞CRMP5表达高于空载体对照组;CRMP5蛋白表达于神经元的胞体和突起,尤其是胞体、突起起始处和突起末端高表达。过表达CRMP5可明显促进突起生长,主要表现为突起的生长,并形成丰富的侧枝;定量结果显示,CRMP5过表达的细胞突起的长度逐渐延长,而且较空载体转染细胞增多,差异显著(P<0.01)。导入CRMP5的细胞突起提取液的吸光度较对照细胞明显升高(P.<0.01)。 结论 CRMP5能促进神经元突起及其分支的生长。     

Genistein对体外培养的Parkinson病模型大鼠多巴胺能神经元及突触素的影响

为了探讨genistein(GST)对离体培养的Parkinson病模型大鼠多巴胺能神经元以及突触素的影响,取孕14~16d SD大鼠胚胎中脑腹侧部,常规体外培养。将培养的中脑腹侧细胞分为四组:正常对照组、雌二醇(E2)+MPP+组、GST+MPP+组、MPP+组。进行四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力和代谢状态。采用TH和突触素(synaptophysin,SYN)免疫荧光组织化学染色技术,观察各组TH阳性神经元的生长状况以及突触数量的变化。结果显示:与正常对照组、E2+MPP+组以及GST+MPP+组相比,MPP+组TH阳性神经元数量少,SYN免疫活性产物表达亦减少,细胞活力差。而E2+MPP+组、GST+MPP+组中上述指标与正常对照组相比,差异无统计学意义。以上结果提示Genistein对体外培养的多巴胺能神经元具有类似雌激素样的神经保护作用。     

GFR-α1在Parkinson病大鼠黑质区的表达

本文观察了胶质细胞源性神经营养因子受体-α1(GFR-α1)在Parkinson病(PD)大鼠黑质区的表达变化。分别向大鼠左侧尾壳核和黑质致密部、中脑腹侧被盖区内注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立部分损伤模型和完全损伤模型后,取大鼠黑质区脑组织作冰冻切片,行GFR-α1和TH免疫组织化学染色,用图像分析系统进行细胞计数。结果表明,在部分损伤组和完全损伤组中,GFR-α1在黑质区神经元及胶质细胞中均有表达,且部分损伤组GFR-α1阳性细胞的分布、数量随受损时程的不同出现差异。TH阳性神经元形态学改变,数量的变化与GFR-α1阳性细胞的分布、数量有着密切的关系。以上结果提示,GFR-α1的表达可能与脑内受损部位细胞的营养、修复、再生有关。     

小鼠凋亡相关新基因PNAS-4真核表达载体的构建、表达及体外抗肿瘤作用

目的：对小鼠凋亡相关新基因PNAS-4（mPNAS-4）进行克隆，构建其真核表达载体，并在小鼠Lewis肺癌细胞系LL2中转染表达；探讨mPNAS-4基因转染LL2细胞过表达所诱导的体外肿瘤细胞凋亡情况。方法：用RT-PCR从小鼠肝脏组织中克隆mPNAS-4编码区cDNA，构建重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4；用脂质体将pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞；用RT—PCR检测转染细胞中mPNAS-4的过表达情况；通过MTT、流式细胞术（FCM）及DNA Ladder分别检测转染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从小鼠肝脏组织中克隆到mPNAS-4全长cDNA并成功构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mPNAS-4，转染小鼠Lewis肺癌LL2细胞可使其mRNA表达明显上调。mPNAS-4过表达能抑制LL2细胞增殖并诱导其凋亡。结论：mPNAS-4过表达对小鼠Lewis肺癌LL2细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用。     

α-突触核蛋白在体外培养SH-SY5Y细胞内过表达可导致氧应激

目的：观察α-突触核蛋白基因在SH-SY5Y细胞内过表达对细胞的影响。 方法： LipofectAMINE法转染SH-SY5Y细胞，用G418对转基因细胞进行筛选，免疫荧光细胞化学检测α-突触核蛋白表达，氧化应激敏感的荧光素探针DCF-DA对活细胞进行染色后用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内氧应激状况，还原型谷胱甘肽测定试剂盒通过分光光度计检测细胞内还原型谷胱甘肽水平。 结果： 转染细胞筛选后，细胞呈α-突触核蛋白免疫反应阳性；转α-突触核蛋白基因细胞内存在DCF信号增强和还原型谷胱甘肽水平下降。 结论： α-突触核蛋白过表达可引起细胞内氧应激，表明α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中可能起重要作用。     

RNA干扰抑制肌腱细胞V型胶原表达对胶原纤维形成的影响

利用RNA干扰技术(RNAi)下调肌腱细胞中V型胶原基因的表达,探讨V型胶原在损伤肌腱修复过程中的作用。分别设计干扰大鼠V型胶原2个亚基COL5α1和COL5α2表达的siRNA序列,转染大鼠肌腱细胞。检测V型胶原在基因和蛋白水平的表达,检测组织工程肌腱的胶原含量和胶原原纤维直径。转染特定的siRNA后,V型胶原2个亚基的基因和蛋白表达被明显抑制。抑制COL5α1和COL5α2亚基对胶原纤维形成的影响不同。本实验探究了V型胶原对胶原纤维生长自聚的影响,为肌腱损伤修复提供有用的基础生物学信息。     

双基因重组腺病毒载体的构建及转染大鼠骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

背景:脑源性神经生长因子对多巴胺能神经元、胆碱能神经元等多种神经元都有广泛作用,能促进干细胞更多的向神经元样细胞分化;低氧诱导因子1α可提高组织和细胞在缺血环境下的生存能力,维持局部成血管微环境方面比任何基因均有更广泛的生理作用。目的:通过构建脑源性神经生长因子联合三点突变型低氧诱导因子1α双基因重组腺病毒载体,探索其转染大鼠骨髓间充质干细胞后2种基因在体外常氧条件下对脊髓损伤促神经再生及血管新生的作用。方法:①利用PCR方法定点突变人低氧诱导因子1α编码区的第402、564和803位氨基酸,将突变后低氧诱导因子1α基因联合脑源性神经生长因子重组入腺病毒pAdEasy-1系统,包装病毒并测定滴度。②以4种病毒液连同空白组共分5组进行后续实验;将病毒液转染入骨髓间充质干细胞内观察转染效率,检测各组转染细胞中脑源性神经生长因子基因及低氧诱导因子1αmRNA和蛋白表达情况。③进一步通过Western blot方法检测各组细胞中低氧诱导因子1α的下游成血管基因血管内皮生长因子蛋白表达情况。结果与结论:①编码区第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸;4种腺病毒重组体构建成功并包装鉴定完毕。②实验组、阳性对照组1脑源性神经生长因子mRNA及蛋白表达量明显高于其他组(P0.05);实验组、阳性对照组2细胞内低氧诱导因子1αmRNA及蛋白表达量、血管内皮生长因子蛋白表达均明显高于其他3组(P0.05)。结果说明单载体双基因腺病毒系统转染骨髓间充质干细胞后不仅能够在常氧条件下大量且高效表达脑源性神经生长因子及低氧诱导因子1α蛋白,还同时能够促进其下游血管内皮生长因子的高效表达,为基因联合细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种新的方向。