RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.     

姜黄素和干扰素γ抑制慢性髓系白血病STAT5基因表达的研究

目的探讨姜黄素和干扰素γ(IFN-γ)对慢性髓系白血病(CML)K562细胞STAT5基因表达的抑制作用及其作用机制.方法运用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性.运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞STAT5 mRNA的变化.运用激光共聚焦显微镜和免疫印迹法检测STAT5蛋白的表达.结果①姜黄素或1FN-γ作用K562细胞24 h,K562细胞增殖活性明显受到抑制,STAT5 mRNA和STAT5蛋白表达降低.②姜黄素与IFN-γ联合干预K562细胞24 h,细胞增殖活性、STAT5 mRNA和蛋白的表达均显著低于姜黄素组(均P＜0.01).结论姜黄素和IFN-γ联用能明显抑制慢性髓系白血病细胞增殖以及STAT5基因表达.     

原癌基因LMO2在白血病细胞的表达及对细胞增殖的影响

目的检测原癌基因LMO2在各种白血病中的表达情况,观察该基因表达量的改变对白血病细胞增殖的影响,探索LMO2在白血病发病中的作用。方法荧光实时定量聚合酶链反应;Western印迹实验;基因转染建立高表达LMO2的白血病细胞株;siRNA干扰技术;细胞克隆形成实验。结果LMO2基因在很多急性髓系和淋巴系白血病患者的表达水平高于慢性白血病患者及正常骨髓细胞,但LMO2转染的K562细胞克隆形成率下降,提示该基因在髓系白血病细胞的表达异常是一种伴随结果而不具有致癌作用。强表达LMO2的Molt-4细胞克隆形成率增加,应用特异siRNA可有效地下调其在Molt-4细胞的表达并使细胞克隆形成率下降,提示LMO2在T细胞白血病细胞中的表达有助于维持其增殖潜力。结论LMO2基因表达异常在T淋巴细胞中具有致癌作用,但在髓系细胞转化中可能只是一种伴随现象。     

Triad1调节K562细胞增殖、凋亡和耐药研究*

目的：研究Triad1对慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562增殖和凋亡的作用以及与伊马替尼（IM）耐药的关系。方法：将K562细胞进行血清饥饿培养,流式细胞仪检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹法检测PCNA等增殖相关蛋白的表达。shRNA干扰K562细胞后细胞周期和凋亡的变化。构建耐药细胞K562R,蛋白免疫印迹法检测K562和K562R细胞中Triad1以及凋亡相关蛋白的表达。结果：（1）血清饥饿培养后K562细胞阻滞在G0/G1期,恢复血清培养后随着K562细胞增殖,Triad1表达减少,而PCNA等蛋白表达增加。（2）干扰Triad1表达后,K562细胞增殖能力增强,G1期细胞减少。（3）K562R细胞Triad1的表达下降,凋亡相关蛋白表达降低。结论：Triad1通过调节细胞周期来调节K562细胞的增殖,干扰Triad1可促进K562细胞增殖,凋亡减少,Triad1表达下降可能与K562细胞耐药相关。     

shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制.方法:针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1,2,3,采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞,RT-PCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1,MRP1,topoⅡ,GST的mRNA水平;蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平;MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度(IC50值).结果:K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显著高于敏感株K562细胞,差异有统计学意义(P<0.01),且VEGF蛋白水平也显著高于K562细胞;转染shRNA后,K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调,其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义(P<0.05),以shRNA3组下调最显著,并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调;转染48 h后K562/A02细胞中MDR1,MRP1及topoⅡ的mRNA水平均出现不同程度下调,以shRNA3组下调最显著,分别下调(39.7±1.21)%,(29.1±0.97)%,(28.2±1.04)%,GST基因表达则无明显变化;阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加,其中以shRNA3组最显著.结论:VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达,不同干扰片段的沉默效果不同,并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,其机制可能与MDR1,MRP1及topo Ⅱ的表达下调有一定的关系.     

基于JNK/AMPK-mTOR调控Bcl-XL对急性髓系白血病细胞化疗敏感度的干预作用

目的:探究基于JNK/AMPK-mTOR调控Bcl-XL对急性髓系白血病细胞化疗敏感度的干预作用。方法:选取2020年1月－2021年1月在台州市中心医院进行的实验,白血病HL-60细胞株经过细胞培养、转染后,分为下调Bcl-XL组、急性髓系白血病组和阴性对照组。免疫细胞化学染色检测Bcl-XL,免疫印迹检测JNK/AMPK-mTOR相关蛋白的表达。结果:下调Bcl-XL组Bcl-XL表达低于急性髓系白血病组和阴性对照组(均P<0.05)。在24、48、72h,下调Bcl-XL组细胞吸光密度值、细胞增殖数均低于急性髓系白血病组和阴性对照组,细胞凋亡数高于急性髓系白血病组和阴性对照组(均P<0.05)。下调Bcl-XL组mTOR、P70S6K、P-JNK、AMPK、IC50值低于其他急性髓系白血病组和阴性对照组(均P<0.05)。结论:下调Bcl-XL可影响JNK/AMPK-mTOR信号通路的活性,参与急性髓系白血病细胞增殖、凋亡的过程,在急性髓系白血病中起作用。     

糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的表达与白血病细胞黏附和侵袭性的关系

目的 比较髓性白血病细胞K562、HL-60和THP-1黏附、迁移能力以及糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D (GPI-PLD)的表达,探讨GPI-PLD表达与不同白血病细胞黏附性、迁移性的关系.方法 采用黏附实验和体外穿膜实验比较3种不同白血病细胞的黏附性和侵袭性;半定量RT-PCR检测这些白血病细胞GPI-PLD和uPAR mRNA的表达水平;免疫印迹法检测细胞GPI-PLD的表达;流式细胞术检测细胞膜uPAR的表达.结果 THP-1细胞中GPI-PLD和uPAR的mRNA及蛋白质表达水平均明显高于K562和HL-60细胞.THP-1细胞对Fn的黏附率显著高于K562、HL-60细胞;THP-1与HL-60细胞体外穿膜侵袭能力显著高于K562细胞.结论 THP-1细胞较K562和HL-60细胞具有较高的黏附和侵袭能力,与其GPI-PLD和锚定蛋白uPAR表达有关.     

MRP1和XIAP基因在急性髓系白血病及细胞株中的表达及临床意义

目的 本研究旨在探讨多药耐药相关蛋白1 (MRP1)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因在急性髓系白血病(AML)患者及K562、K562/ADM细胞株中的表达,探讨其在AML发生及多药耐药中的意义.方法 应用实时荧光定量PCR方法和蛋白免疫印迹法检测81例AML患者与20例正常人骨髓细胞(对照组),以及K562、K562/ADM细胞株中MRP1、XIAP基因mRNA及蛋白表达.结果 K562/ADM细胞MRP1、XIAP基因mRNA及蛋白水平明显高于K562细胞(P＜0.05).AML患者初治组和复发难治组MRP1、XIAP基因mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P＜0.05),复发难治组MRP1、XIAP基因mRNA及蛋白表达水平明显高于初治组(P＜0.05).结论 MRP1、XIAP基因的异常表达与白血病发病及复发密切相关,可能通过诱导白血病细胞耐药及抑制细胞凋亡的途径发挥作用,其表达水平的高低对评估AML患者预后及治疗效果有重要意义.     

姜黄素和干扰素γ抑制慢性髓系白血病STATS基因表达的研究

目的 探讨姜黄素和干扰素γ（IFN-γ）对慢性髓系白血病（CML）K562细胞STAT5基因表达的抑制作用及其作用机制。方法 运用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性。运用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测细胞STAT5 mRNA的变化。运用激光共聚焦显微镜和免疫印迹法检测STATS蛋白的表达。结果 ①姜黄索或IFN-γ作用K562细胞24h，K562细胞增殖活性明显受到抑制，STAT5 mRNA和STAT5蛋白表达降低。②姜黄素与IFN-γ联合干预K562细胞24h。细胞增殖活性、STAT5 mRNA和蛋白的表达均显著低于姜黄素组（均P％0．01）。结论 姜黄素和IFN-γ联用能明显抑制慢性髓系白血病细胞增殖以及STAT5基因表达。     

丙戊酸钠对K562细胞的增殖抑制作用

目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对慢性髓系白血病细胞株K562的增殖抑制作用.方法:噻唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度VPA对K562细胞增殖的抑制作用;Western Blot法检测K562细胞Bax和Bcl-2蛋白的表达.结果:VPA能显著抑制K562细胞的增殖(P＜0.01),VPA处理K562细胞72h的半数抑制浓度(IC50)为(2.34±0.14)mmol/L;3mmol/L VPA处理K562细胞72h后,Bax蛋白的表达明显升高、Bcl-2蛋白的表达明显降低.结论:VPA可通过上调Bax的表达、下调Bcl-2的表达抑制K562细胞增殖,诱导K562细胞凋亡.     

NK细胞抑制CD34+早期急性髓系白血病细胞克隆形吵

目的 探讨同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的克隆抑制效应.方法 免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,甲基纤维素克隆形成实验检测NK细胞对KG1a细胞杀伤后的克隆形成,同时与NK杀伤敏感细胞株K562比较.结果 急性髓系白血病细胞株KG1a中CD34抗原表达率为(98.0±1.1)%,分选后的NK细胞(CD3-CD16 CD56 细胞)纯度为(93.2±3.7)%.不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均能抑制其克隆形成.随着效靶比的增高,其克隆抑制率随之增高(P＜0.05).同一效靶比时,NK细胞对KG1a的克隆抑制率低于K562,差异有显著性(P＜0.05).结论同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的克隆形成具有一定的抑制作用.     

NK细胞抑制CD34^＋早期急性髓系白血病细胞克隆形成

目的 探讨同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的克隆抑制效应.方法 免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,甲基纤维素克隆形成实验检测NK细胞对KG1a细胞杀伤后的克隆形成,同时与NK杀伤敏感细胞株K562比较.结果 急性髓系白血病细胞株KG1a中CD34抗原表达率为(98.0±1.1)%,分选后的NK细胞(CD3-CD16 CD56 细胞)纯度为(93.2±3.7)%.不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均能抑制其克隆形成.随着效靶比的增高,其克隆抑制率随之增高(P＜0.05).同一效靶比时,NK细胞对KG1a的克隆抑制率低于K562,差异有显著性(P＜0.05).结论同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的克隆形成具有一定的抑制作用.     

三氧化二砷抑制cdc2基因表达诱导K562白血病细胞G2/M周期停滞

目的检测三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)诱导慢性髓系白血病急变细胞K562周期停滞中细胞周期相关调节基因的转录、蛋白表达及其磷酸化改变,以期阐明As2O3诱导其周期停滞的分子生物学机制,为克服K562细胞的As2O3抵抗性提供实验基础。方法体外培养K562细胞,采用PI染色、流式细胞仪检测As2O3作用后细胞周期分布的改变;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞周期相关调节基因mRNA表达变化;Westernblot检测相关蛋白及磷酸化改变。结果As2O3作用K562细胞24h后,G2/M期细胞比例明显增加,浓度为0、2、5、10μmol/L时G2/M期细胞比例分别为(22.6±3.4)%、(27.2±2.3)%、(43.8±4.5)%、(36.7±4.1)%;K562细胞在As2O3处理前有Sur-vivin、cdc2、chk1基因表达,As2O3处理后Survivin、chk1的表达无明显变化,但cdc2表达呈浓度依赖性下调;As2O3作用前可见Survivin、cdc2、cdc2-p、chk1等4种蛋白的表达,作用24h后,Survivin的表达条带增强,cdc2蛋白表达水平呈浓度依赖性下调,cdc2-p水平在2～5μmol/L时无明显变化,在10μmol/L时受抑明显,chk1蛋白表达水平在As2O3作用前后无明显改变。结论As2O3显著诱导K562白血病细胞G2/M周期停滞,其机制与抑制cdc2转录水平,下调活性化cdc2蛋白表达有关。不能有效抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达可能是K562白血病细胞对As2O3诱导凋亡抵抗的一个重要机制。     

RNA干扰PCGF4/Bmi-1抑制白血病K562细胞系增殖

目的:利用RNAi方法针对PCGF4/Bmi-1基因,抑制其在慢性髓性白血病K562细胞中的过表达,观察K562细胞的增殖性改变。方法:RT-PCR检测PCGF4/Bmi-1基因在K562中的表达情况。利用Invitrogen公司RNAi慢病毒表达载体系统,构建针对PCGF4/Bmi-1基因慢病毒RNAi表达载体。转染K562细胞,瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的表达,实时定量PCR检测干扰前后基因表达变化。利用生长曲线测定干扰载体转染前后细胞生长速度变化。结果:PCGF4/Bmi-1慢病毒RNAi表达载体成功地构建,并建立瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的K562细胞系。实时定量PCR检测,PCGF4/Bmi-1基因在K562细胞系中过表达被显著抑制。生长曲线测定,PCGF4/Bmi-1基因干扰后细胞增殖明显变慢。结论:干扰PCGF4/Bmi-1基因,降低该基因表达后能明显减低细胞的生长速度。     

四嗪二甲酰胺对K562和K562/Adr的作用及其与NF-κB信号分子的关系

目的探讨四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)对慢性粒细胞白血病细胞株K562(K562-S)和耐药细胞株K562/Adr(K562-R)的抑制作用及其对p210 BCR/Ab l融合蛋白和转录核因子κB(NF-κB)表达的影响。方法 MTT比色法观察其对K562-S细胞增殖的抑制作用,采用Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞仪及细胞克隆形成初步分析其对白血病干细胞的影响,通过Western印迹分析PARP-1、p210 BCR/Abl、c-Abl、NF-κB的表达。结果不同浓度的ZGDHu-1对K562-S细胞均有增殖抑制作用,呈现剂量-时间依赖关系,ZGDHu-1作用48h时的IC50值为0.25μg/ml。在ZGDHu-1作用7天后,K562-S及K562-R细胞克隆形成被完全抑制。ZGDHu-1作用48h后,出现PARP-1裂解,诱发细胞凋亡,下调K562-R细胞p210 BCR/Abl及c-Abl的表达,抑制K562-S及K562-R细胞质内NF-κB/p65的表达。结论 ZGDHu-1能够抑制K562-S及耐药细胞株K562/Adr(K562-R)细胞的增殖,促进细胞凋亡。通过抑制p210 BCR/Abl的表达,降低NF-κB的活性,阻断NF-κB信号传导通路,尤其对于耐药型白血病细胞具有广泛的应用价值。     

同种异体NK细胞对CD34+早期急性髓系白血病细胞的细胞毒效应

目的 探讨同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的细胞毒效应.方法 免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,乳酸脱氢酶释放法测定不同效靶比时NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞KG1a的杀伤活性,甲基纤维素克隆形成实验检测NK细胞对KG1a细胞的克隆形成抑制率,同时与NK杀伤敏感细胞株K562比较.结果 急性髓系白血病细胞株KG1a中CD34抗原表达率为(98.0±1.1)%,分选后的NK细胞(CD3CDl6 CD56 细胞)纯度为(93.2±3.7)%.不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均有杀伤活性,均能抑制其克隆形成.随着效靶比的增高,其杀伤活性和克隆抑制率随之增高(P＜0.05).同一效靶比时,NK细胞对KG1a的杀伤活性和克隆抑制率低于K562(P＜0.05).结论 同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞具有细胞毒效应.     

PcDNA3．1-rhGM-CSF重组质粒的构建及生物活性鉴定

目的构建PcDNA3．1-rhGM-CSF真核细胞表达载体,初步观察其对髓系白血病细胞K562细胞生长的影响。方法采用PCR、T—A克隆及基因定向克隆技术,将mG胁CSF基因插入PcDNA3．1（＋）空载体,构建了PcDNA3．1-rhGM—CSF真核表达载体。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染人髓系白血病细胞K562细胞72h后,采用RT-PCR方法、NBT试验、MTT试验、免疫组化技术,观察和分析PcDNA3．1-rhGM—CSF在K562细胞中的表达及其对该细胞的影响。结论成功构建了PcDNA3．1-rhGM—CSF真核细胞表达载体;重组质粒PcDNA3．1-rh—GM—CSF能在K562细胞中表达;部分K562细胞向单核细胞系、巨噬细胞系分化。     

四嗪二甲酰胺对K562和K562/Adr的作用及其与NF-KB信号分子的关系

目的 探讨四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)对慢性粒细胞白血病细胞株K562(K562-S)和耐药细胞株K562/Adr(K562-R)的抑制作用及其对p210 BCR/Abl融合蛋白和转录核因子KB(NF-KB)表达的影响.方法 MTT比色法观察其对K562-S细胞增殖的抑制作用,采用Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞仪及细胞克隆形成初步分析其对白血病干细胞的影响,通过Western印迹分析PARP-1、p210 BCR/Abl、C-Abl、NF-KB的表达.结果 不同浓度的ZGDHu-1对K562-S细胞均有增殖抑制作用,呈现剂量-时间依赖关系,ZGDHu-1作用48h时的,IC<,50>值为0.25μg/ml.在ZGDHu-1作用7天后,K562-S及K562-R细胞克隆形成被完全抑制.ZGDHu-1作用48h后,出现PARP-1裂解,诱发细胞凋亡,下调K562-R细胞p210 BCR/Abl及c-Abl的表达,抑制K562-S及K562-R细胞质内NF-KB/p65的表达.结论 ZGDHu-1能够抑制K562-S及耐药细胞株K562/Adr(K562-R)细胞的增殖,促进细胞凋亡.通过抑制p210 BCR/Abl的表达,降低NF-KB的活性,阻断NF-KB信号传导通路,尤其对于耐药型白血病细胞具有广泛的应用价值.     

SHP1基因诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡及红系分化

目的探讨SHP1基因在诱导K562细胞凋亡及红系分化中的作用。方法应用RT-PCR法克隆SHP1基因全长cDNA序列并克隆于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体转染使其基因在K562细胞中过表达。Hoechst33258染色和FACS(AnnexinⅤ-PI双标)分析检测转基因后K562细胞凋亡;联苯胺蓝染色和血型糖蛋白A(GPA)表达检测分析细胞分化情况。结果 pcDNA3-SHP1转染K562细胞,RT-PCR、蛋白免疫印迹分析证实SHP1在K562细胞中表达。转染48h后,K562细胞出现凋亡,AnnexinⅤ-PI双标FACS分析细胞凋亡率为16.84%,与转染空载体pcDNA3.0(6.23%)相比差异有统计学意义(P=0.000)。联苯胺蓝染色细胞阳性率14.67%,GPA表达率19.38%,与转染空载体组比较差异也有统计学意义(P=0.005)。结论 SHP1能有效地诱导K562细胞凋亡与红系分化。     

分化抑制因子Id4对K562细胞株凋亡的影响

目的探讨Id4基因的反义核酸对人红白血病K562细胞凋亡的影响。方法采用脂质体介导的反义寡核苷酸转染DNA重组技术,将人反义Id4基因插入到真核表达载体pXJ41-neo上,重组质粒和空载体分别转染K562细胞,加入凋亡诱导剂三尖杉酯碱(HT)后采用流式细胞术、TUNEL和免疫印迹(Western blot)技术检测细胞的凋亡率以及相关蛋白Bcl-xl、c-Myc、p27的表达变化。结果获得了pAId4(反义基因重组质粒)和pK562(对照)克隆细胞株;加入诱导剂HT后,反义寡核苷酸组的凋亡率明显增高到43.5%;检测K562细胞凋亡过程中,Bcl-xl蛋白在pAId4细胞株中表达减低。结论反义Id4基因的转入对K562细胞起到诱导凋亡作用,并推测Id4在K562细胞中可能通过影响Bcl-xl的表达量,进一步诱导细胞凋亡。