聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症研究中的应用

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性分析（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR－SSCP）在家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia,FH)研究中的应用价值。方法：提取FH患者外周血基因组DNA，进行PCR－SSCP及DNA序列分析。结果：对1家2例临床诊断为FH的患儿及其父母从基因水平明确了诊断。LDL受体基因突变是位于第6外显子的移框突变，结论：PCR－SSCCP可以从基因水平对FH患者明确诊断，并可对先证者家族系成员早期诊断，以便提供咨询和指导。     

胰岛素受体底物—1基因3′非翻译区的突变与中国人2型糖尿病的关系

目的：研究胰岛素受体底物－1（IRS－1）基因3′非翻译区的突变与中国2型糖尿病的关系。方法：采用PCR－SSCP技术扫描120例中国2型糖尿病患者和120例正常对照的IRS－1基因3′非翻译区序列，所有SSCP变异的样品进行DNA测序分析。结果：SSCP分析存在假阳性结果。测序未发现有基因突变。结论：IRS－1基因3′非翻译区的突变不是引起中国人2型糖尿病的重要遗传因素。     

女性性早熟患儿雌激素受体突变的检测

目的：本研究为探讨女孩性早熟患者雌激素受体基因编码的可能完善。方法：收集了16例未见血液雌激素水平升高的临床女孩性早熟患者的外周血样本，抽提血液DNA，以PCR—SSCP方法筛查雌激素受体基因编码区的可能突变。结果：在l例患者的雌激素受体基因8号外显子发现单链构象变化。测序结果证明单链构象变化是由1个单核苷酸突变引起，此突变发生于编码548位精氨酸密码子，1个C—T转换导致精氨酸残基被半胱氨酸所替代。这一突变使DNA序列中产生1个BtsL酶切位点，可通过P(R-RFLP对突变进行快速甄别，实验证明此患者为Arg548／Cys548杂合体。结论：由于这一残基在不同动物ER中的保守性质、以及突变所造成的疏水性的急剧加大，推测此突变将强烈改变雌激素受体的性质。     

低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因A1330V遗传多态性与高胆固醇血症的关系

目的 探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)基因第1330位由丙氨酸向颉氨酸突变(A1330V)的遗传多态性和高胆固醇血症的发病易感性之间的关系.方法 用聚合酶链反应(PCR)直接测序,对346例正常者和432例原发性高胆固醇血症患者的A1330V基因多态性进行研究.结果 在高胆固醇血症患者中,1330V突变等位基因的发生频率为0.22,而在健康对照组中,1330V突变等位基因的频率为0.14.1 330 V等位基因的频率在原发性高胆固醇血症患者和健康对照组之间差异存在显著性(x2=16.24,P＜0.01),并且此差异只存在于男性人群中,女性人群未见统计学差异.结论 LRP5的1330V等位基因是男性人群原发性高胆固醇血症的遗传易感因素.     

国人家族性载脂蛋白B-100缺陷症的检测

目的：检测广州地区高胆固醇血症患者载脂蛋白B-100可能存在的突变体。方法：应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增APOB基因第26外显子编码10549—10895号核苷酸的DNA片段，用地高辛配基标记的等位基因特异寡核苷酸探针进行斑点杂交，分析受检者的载脂蛋白B-100基因是否存在密码子3531CGC→CGT突变。结果：362例原发性高胆同醇血症患者中未检出上述基因突变。结论：上述基因突变在广州人群中不存在或发生率很低。     

变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性分析检测皮肤癌p53基因突变的比较

目的：检测皮肤癌p53基因5－8外显子的突变频率,比较变性和梯度凝胶电泳（DGGE）和单链构象多态性分析（SSCP）检测p53基因突变的敏感性,方法：分别采用DGGE和SSCP,对40例皮肤癌患者手术切除组织的p53基因5－8外显子进行突变检测。结果：皮肤癌p53基因5－8外显子的总突变率为35％,其中鳞状细胞癌（SCC）的突变率为36％,基底细胞癌（BCC）为33％,采用GGE和SSCP检测的突变率分别为33％和25％。结论35％的皮肤癌组织存在p53基因5－8外显子突变。GGE检测p53基因突变的敏感性高于SSCP。DGGE结合SSCP有助于提高突变检出率。     

自身免疫性甲状腺病TSH受体基因第一外显子突变的研究

目的 探讨自身免疫性甲状腺病发病与TSH受体基因第一外显子突变之间的关系。方法 用PCR－SSCP方法对146例Graves病，30例桥本甲状腺炎患者外周血白细胞DNA TSH受体基因第一外显子突变进行筛查。结果 经PCR扩增后均出现明晰可辨的带型，SSCP分析176例无1例出现异常泳动。结论 PCR－SSCP分析未发现自身免疫性甲状腺病患者TSH受体基因第一外显子有突变，提示自身免疫性甲状腺病发病可能与TSH受体基因第一外显子突变无关。     

载脂蛋白B-100基因突变与脂蛋白代谢及动脉粥样硬化

载脂蛋白B-100(apoB-100)是低密度脂蛋白(LDL)的重要组分之一，对于维持LDL结构的完整及血清胆固醇水平的相对稳定起着重要的作用。apoB-100及其结构上的变化在高血脂及动脉粥样硬化方面所起到的作用和影响非常巨大。目前apoB-100的编码基因及蛋白质的部分结构已基本阐明，已发现了一些结构域和决定其主要生物功能的LDL受体结合部位中，能明显影响其结构与功能的基因突变点，即第3500氨基酸突变(R3500Q、R3500W)及第3531氨基酸突变(R3531C)。apoB-100结构上的变异均不同程度地减低apoB-100与LDL受体结合的能力，其中最为重要的变异是R3500Q，可直接导致个体高脂血症的发生。本文对apoB-100基因突变所造成其结构上的变异及这种变异与高脂血症、动脉粥样硬化的关系进行了综述。     

低密度脂蛋白受体的变异与家族性高胆固醇血症

低密度脂蛋白受体主要功能是摄取血中的胆固醇至细胞内，家族性高胆固醇血症与患者低密度脂蛋白受体的缺陷有关，低密度脂蛋白受体基因的不同突变可突变可造成受体的不同缺陷，故对家族性高胆固醇血症患者可进行基因诊断和基因治疗。     

血脂紊乱和糖尿病大血管并发症以及胰岛素抵抗

目的：调查糖尿病患者血脂紊的类型,分析血脂紊乱对大血管病变及胰岛素抵抗的影响。方法：2430例糖尿病患者完成糖尿病并发症筛查,血生化检查和胰岛β细胞功能测定,按照血脂分类标准,分为单纯高胆固醇血症（HY－C组）、高甘油三酯血症（HY－T）、高胆固醇高甘油三酯血症（HY－C－T）组、低HDL－胆固醇血症（L－HDL）、高胆固醇高甘油三酯低HDL血症组（HY－C－T－L－HDL）,以血脂正常的糖尿病患者以为对照组,比较各组大血管病变事件率,高血压率和胰岛素抵抗指数（HOMA－IR）以及有关指标。结果：糖尿病人群中血脂紊乱的检出率为63．8％,其中HY－C－T为23．9％,HY－C为16．1％,HY－T和15．0％,L－HDL为5．5％,HY－C－T－HDL为3．3％,与对照组相比较,HY－T组,HY－C－T组中女性的比例明显增加,除HY－C组外,其他血脂异常组患者的BMI和WHR均明显高于对照组,HY－C－T组的大血管病变检出率明显高于对照组,该组及高胆固醇血症组,高甘油三酯血症组的平均血压以及高血压患者的检出率明显高于对照组,血脂异常组的微血管病变检出率与对照组差异无显著性,HY－C－T组和HY－C－T－L－HDL组的空腹胰岛素明显高于对照组,除L－HDL组外,各血脂异常组的胰岛素抵抗指数均高于对照组,以HY－C－L－HDL组胰岛抵抗最为严重。我国糖尿病合并高血脂发病率高,血脂紊乱重胰岛素抵抗,是糖尿病大血管病变的重要危险因素。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的：获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体，进行核苷酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法：利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经kpnI、BamHI双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因，与GenBank的报道相比较，有1．4％的bp发生变异，1．6％的氨基酸残基改变。其同源性高达98％。结论：成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

中国汉族乳腺癌家系中BRCA1和BRCA2基因的胚系突变

目的 检测中国家族性乳腺癌中BRCA1和BRCA2的胚系突变位点。方法 对象为来自汉族的14个乳腺癌家系中的15例乳腺癌患者、散发性乳腺癌患者76例和正常对照100名,知情同意后取其外周静脉血,提取基因组DNA,用15例家族性乳腺癌患者和2份pool DNA(每份pool DNA含50名正常对照者的等量DNA)作为样本,对BRCA1基因外显子4、8、11、18、19、20和部分内含子区域,BRCA2基因外显子1～14、外显子17～24和外显子27及部分内含子区域进行序列测定。用DNA Star软件进行序列比较分析,筛查基因突变位点及多态性位点,对有意义的突变位点在正常对照和散发性乳腺癌患者中进行基因分型。结果 在BRCA1的外显子11上发现6个单核苷酸多态性(SNP)位点,2个不改变氨基酸编码,4个改变氨基酸编码。其中2个为致病性位点：一个致病位点为G 1235A(Trp 372 stop),导致蛋白质合成终止,该位点仅在1例29岁的家族性乳腺癌患者中发现;另一致病位点C 1196 T(Pro 359 Leu)也只在1例37岁的家族性乳腺癌患者中发现,该位点在正常对照和散发性乳腺癌患者中进行基因分型后均为野生型,并在相关的文献和乳腺癌信息中心网站的突变数据库中均未检索到,为一新的中国家族性乳腺癌特有的致病位点。在BRCA2的外显子3、10及11中发现8个SNP位点,5个不改变氨基酸编码,3个改变氨基酸的编码,其中2个位点A 1093 C(Asn 289 His)和A 3199 G(Asn 991 Asp)在2个pool DNA样本中均为野生型。结论 在BRCA1上发现两个致病的SNP,可能与早发型乳腺癌有关,其中一个可能是中国家族性乳腺癌特有的新的突变位点。     

细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段的分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E．granulosus）Eg10基因片段，并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴，提取总RNA，根据GeneBank公布的细粒棘球蚴Eg10基因片段已知序列，设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株k10基因片段，测序为938bp，该基因序列与检索基因核苷酸序列同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性亦为100％。结论 测序的k10基因序列有完整的编码框（765bp），对于进一步研究其结构和功能及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组栽体，进行核甘酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因，与GenBank公布的序列相比较，有l.8％的bp发生变异，0．35％的氨基酸残基改变，但同源性高达98％。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

中国人丙型肝炎病毒囊膜蛋白2HVR1 cDNA的序列分析

目的：了解中国ＨＣＶ流行株高变区１（ＨＶＲ１）的特点。方法：对来自山东（ＳＤ）、上海（ＳＨ）两地患者血清ＲＮＡ进行逆转录－巢式ＰＣＲ，扩增ＨＣＶ囊膜蛋白２基因片段，用ＰＣＲ直接测序法对该片段进行序列测定。结果：（１）扩增片段（命名为Ｐ３８８）对应于日本ＨＣＶ－Ｊ株序列核苷酸１４３９￣１８２６位（氨基酸位３７１￣４９８）；（２）中国人ＨＣＶ ＨＶＲ１位于氨基酸位３８４￣４１０，与发表的ＨＣＶⅡ型ＨＶ     

Cloning of the Gene Encoding Urease Subunit.A in Helicobacter Pylori

Themostefficient ,economicalapproachwithlowriskofadversereactiontothepreventionandcon trolofHelicobacterpylori (H .pylori)infectionistousevaccine .UreaseanditssubunitAisproventobethemainvaccineagainsttheinfectionofH .pylori.Inordertoexpresstheureasesubuni…     

先天性心脏病患者GATA4基因新突变的识别

目的 识别先天性心脏病(CHD)患者新的分子病因.方法 收集120例特发性CHD患者的临床资料和血标本,以100名健康者为对照.应用聚合酶链反应扩增GATA4基因的全部外显子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序.借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变,并用Clustal W 软件分析突变氨基酸的保守性.结果 3例CHD患者的GATA4基因各识别出1个新的杂合错义突变,即第90、95和329位的密码子分别由AGC、GAC和AAG变为AGA、GAG和AAT,导致第90、95和329位的氨基酸分别由丝氨酸、天冬氨酸和赖氨酸变为精氨酸、谷氨酸和天冬酰胺,即S90R、D95E和K329N突变.这些突变在正常对照者中均不存在,多物种GATA4序列比对显示第329位的赖氨酸在进化上高度保守.此外,还发现了1个不改变氨基酸的单核甘酸多态,即c.99 G>T多态,但这些多态在CHD患者和健康对照者间的频率分布差异无统计学意义(P>0.05).结论 特发性CHD具有显著的遗传异质性,GATA4基因突变可能是部分特发性CHD患者的分子病因.     

中国人群迟发性耳聋家系及散发病例凝血因子C同源物基因突变分析

目的分析中国常染色体显性遗传非综合征性耳聋（DFNA）群体凝血因子C同源物（COCH）基因突变发生率及突变谱。方法在我国汉族人群中收集26个DFNA家系、19个遗传方式不明的迟发性耳聋小家系、22例迟发性耳聋散发病例和100例正常对照者的临床资料及外周静脉血并提取DNA,采取PCR扩增后直接测序的方法进行COCH全序列突变分析。结果在1个巨大DFNA家系中发现COCH 1625G〉A杂合突变,使原来542位的半胱氨酸突变成酪氨酸（C542Y）;在1个遗传方式不明的迟发性耳聋小家系中发现COCH 1535 T〉C杂合突变,使512位蛋氨酸突变为苏氨酸（M512T）。进化保守性分析提示C542、M512在小鼠、牛、鸡和斑马鱼中高度保守。2个家系成员的表现型与基因型共分离。100例正常对照未见COCH突变。结论COCH M512T和C542Y突变是这2个迟发性耳聋家系患者致聋的分子病因。