单核/巨噬细胞在缺氧微环境下对Tca8113舌鳞癌细胞系杀伤作用的实验研究

目的:探讨缺氧微环境下单核/巨噬细胞对舌鳞癌细胞吞噬和杀伤作用的影响.方法:从健康人的外周血中分离单核细胞后通过培养将其转化为单核/巨噬细胞;分别在常氧(20% O_2)和缺氧(O_2<1%)条件下进行单核巨噬细胞和舌鳞癌细胞Tca 8113的混合培养,4 h后MTT法检测单核/巨噬细胞对细胞的杀伤作用.结果:在缺氧微环境下,单核/巨噬细胞对舌癌细胞株的杀伤作用低于常氧环境下(P<0.05).结论:在缺氧的微环境下,单核/巨噬细胞对舌癌细胞株的吞噬、杀伤作用减弱,但单核/巨噬细胞在肿瘤组织中的作用的具体机制及在肿瘤免疫治疗中的意义还需进一步研究.     

舌癌酸性环境下雷公藤多甙对单核/巨噬细胞杀伤活性的影响

目的　通过模拟舌癌局部的酸性环境,加入雷公藤多甙（TWP）,检测其对单核/巨噬细胞杀伤肿瘤细胞功能的影响。方法在pH值6.6,6.8酸性环境中,人单核/巨噬细胞THP-1与人舌鳞癌细胞Tca8113共同培养,经不同浓度的TWP干预,MTT法检测Tca8113细胞数量变化,观察此舌癌酸性环境下TWP对单核/巨噬细胞杀伤舌癌细胞作用的影响。结果酸性环境下,经不同浓度TWP干预,THP-1细胞与Tca8113细胞共同培养4小时,THP-1细胞杀伤活性随TWP浓度增加而增大,与浓度成正相关(P<0.05);pH值为6.6,TWP浓度为5×10-1μg/ml时,THP-1细胞杀伤活性随时间延长而增加,与时间成正相关(P<0.05)。结论体外模拟的舌癌酸性环境中,经一定浓度的雷公藤多甙干预,可使单核/巨噬细胞杀伤活性较未干预组增强,与药物浓度及时间成正相关。     

舌鳞癌酸性微环境下雷公藤多甙对单核-巨噬细胞分泌血管内皮生长因子的影响

目的 检测雷公藤多甙(tripterygium wilfordii polyglycosidium,TWP)在模拟舌鳞癌局部酸性微环境下对单核-巨噬细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响.方法 在pH值6.6、6.8酸性微环境中,用对数生长期的Tca8113细胞培养上清液与人单核-巨噬细胞系THP-1细胞混合培养,经不同浓度的TWP干预及干预不同时间,以酶联免疫吸附测定法检测其对THP-1细胞分泌VEGF的影响.结果 THP-1细胞与Tca8113细胞上清液混合培养4h,THP-1细胞分泌VEGF受到抑制,分泌抑制率随TWP浓度增加而增大,与浓度成正相关(pH值6.6时,r=0.983,P＜0.001;pH值6.8时,r=0.971,P＜0.001).pH值为6.6,TWP浓度为5×10-1μg/mL时,分泌VEGF抑制率随时间延长而增大,与时间成正相关(r=0.975,P＜0.05).结论 体外模拟的舌鳞癌酸性微环境中,TWP抑制单核-巨噬细胞分泌VEGF,抑制率分别与药物浓度及作用时间正相关.     

口腔癌相关成纤维细胞对舌癌细胞株侵袭特性的影响

目的 采用重建基底膜细胞侵袭实验,研究直接分离自舌癌组织旁的癌相关成纤维细胞（CAFs）对舌癌细胞株侵袭特性的影响,探讨CAFs在口腔鳞癌发展中的作用。方法 以Matrigel模拟重建基底膜,采用Transwell小室建立口腔CAFs与舌癌细胞株Tca8113的交互作用模型,观测CAFs对Tca8113侵袭特性的影响。结果 与正常成纤维细胞（NFs）相比,CAFs能促使更多的Tca8113细胞穿透Matrigel（P<0.05）。结论 口腔CAFs能促进舌癌细胞株Tca8113
的侵袭,在口腔鳞癌发展中起重要作用。     

腺病毒介导CD/5-FC系统治疗舌癌的实验研究

目的:探讨胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对舌癌细胞株的治疗效果。方法:应用透射电镜、RT-PCR检测含CD基因的重组腺病毒(AdCMVCD)对舌癌细胞株Tca8113的转染及表达情况,MTT法检测AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应,FCM检测该系统对舌癌细胞周期的影响。结果: AdCMVCD可转染入舌癌细胞的胞核并表达CD基因;AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞具有强杀伤作用和旁观者效应;FCM检测结果显示舌癌细胞S期比率显著升高(P<01001),G2+M期比率下降为0(P<01001),G1/G0期的改变不明显(P>0105)。结论:AdCMVCD/5-FC自杀基因系统对舌癌细胞株具有强的杀伤作用,杀伤作用具有细胞周期 (S期)特异性。     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究

目的探讨乳铁蛋白(lactoferrin)对舌癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达调控的情况。方法采用四甲基氮唑蓝实验(MTT)、RT-PCR法检测乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖作用及VEGFmRNA表达改变的情况。结果乳铁蛋白显著抑制Tca8113细胞的增殖,呈剂量依赖性,乳铁蛋白对Tca8113细胞VEGF的RT-PCR产物试验组(2和3)与对照组之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖有抑制作用,可以降低细胞中VEGFmRNA的表达水平,为乳铁蛋白用于肿瘤的预防及治疗提供实验基础。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因抑制舌鳞癌细胞血管内皮生长因子表达的实验研究

目的探讨诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因对舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达调控情况。方法以RNA干扰技术将含有iNOS基因的特异性（short hairpin RNA，shRNA）片断的质粒表达载体转染入Tca8113细胞中，RT-PCR和Western blot法分别检测iNOS、VEGF的mRNA、蛋白表达改变情况。结果Tca8113细胞的iNOS对VEGF基因的PCR产物，在转染后24、48h实验组和对照组之间比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；iNOS基因的蛋白产物在转染后36、48h差异均有统计学意义（P〈0．05）。VEGF基因的蛋白产物在转染后48h差异有统计学意义（P〈0．05）。结论以RNA干扰技术沉默Tca8113细胞中iNOS基因，可以降低细胞中VEGF的表达水平，iNOS基因可能成为肿瘤防治的新靶点。     

人内皮抑素基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生长的影响

目的 探讨人内皮抑素(hES)基因导入舌鳞癌Tca8113细胞后的表达情况及其抑制肿瘤生长效应。方法 以脂质体为载体将hES基因导入Tca8113细胞,通过动物实验观察转基因Tca8113细胞移植瘤生长情况,免疫组织化学检测肿瘤组织中hES及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,Weidner法行肿瘤微血管密度(MVD)计数,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果 移植瘤生长第27天,实验组肿瘤组织中hES的表达率高于对照组(P<0.01);VEGF的表达率低于对照组(P<0.01)。实验组MVD计数低于对照组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡率则明显高于对照组(P<0.01)。hES基因转染对肿瘤生长的抑制率78.9％。结论 hES基因转染舌鳞癌细胞可体内诱导hES蛋白高效表达并具有抑制移植瘤生长的效应。     

肿瘤相关成纤维细胞促进舌鳞癌细胞上皮间质转化

目的：检测舌鳞癌组织中肿瘤相关成纤维细胞是否诱导舌癌细胞的上皮间质转化。方法：通过体外原代培养舌鳞癌组织肿瘤相关成纤维细胞的培养上清作用于舌鳞癌细胞系Tca8113,通过检测细胞形态确认肿瘤细胞是否发生上皮间质转化。利用实时定量PCR及免疫印迹检测舌鳞癌细胞上皮标志及间质标志物表达。利用TGF-β/Smad信号通路阻断剂探究TGF-β在此过程的作用。结果：肿瘤相关成纤维细胞促进Tca8113的上皮间质转化。利用实时定量PCR检测及免疫印迹发现肿瘤相关成纤维细胞可以明显促进Tca8113细胞的Vimentin的表达。SB431542,TGF-β/Smad信号通路特异性阻断剂可明显阻断肿瘤相关成纤维细胞条件培养基对Tca8113上皮间质转化的诱导作用。结论：舌鳞癌组织中的肿瘤成纤维细胞可通过诱导舌鳞癌细胞的上皮间质转化促进舌鳞癌细胞的迁移及侵袭,可能在肿瘤发展过程发挥重要作用。     

PU-VEGF-siRNA对裸鼠皮下舌癌移植瘤生长的影响

目的：探讨针对血管内皮生长因子WEGF）的小干扰RNA（siRNA）对舌癌Tca8113细胞移植瘤在裸鼠体内生长的影响。方法：将两对特异性针对VEGF的siRNA真核表达载体（PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2）,经脂质体转染人舌癌TCA8113细胞,经G418筛选后获得稳定表达,以空载体组做实验对照,以未转染舌癌细胞作空白对照。将各组细胞接种裸鼠背部皮下,每组5只,观察裸鼠肿瘤生长情况,免疫组织化学染色法观察裸鼠肿瘤组织VEGF的表达。结果：与实验对照组和空白对照组相比,实验组肿瘤生长速度明显减缓,VEGF表达降低（P〈0.05）。结论：siRNA抑制VEGF的表达,可显著抑制舌癌移植瘤在裸鼠体内的生长。     

人巨噬细胞与Tca8113细胞融合瘤苗的制备及体外抗肿瘤效应

目的 探讨巨噬细胞融合瘤苗在舌癌免疫治疗中的应用。方法 利用人巨噬细胞与Tca8113细胞融合，通过磁微珠筛选出融合细胞(FC)并扩大培养，观察Fc的生物学特性及其体外诱导抗肿瘤特异性免疫的能力。结果 FC瘤苗的生长低于其亲本Tca8113细胞，流式细胞仪检测融合细胞的主要组织相容性抗原(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子的表达高于Tca8113，能有效刺激混合淋巴细胞反应(MLR)，并能在体外诱导淋巴细胞抑制肿瘤细胞Tca8113的生长。结论 融合细胞瘤苗能显著提高亲源舌癌细胞Tca8113的免疫原性，提示融合细胞瘤苗是一种新的抗肿瘤免疫治疗方法，可作为个体化肿瘤疫苗的新方案。     

Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用

目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

低氧诱导下Tca8113细胞HIF-1α与VEGF的表达及血管生成相关性研究

目的:研究在体外缺氧培养条件下舌鳞癌细胞系Tca8113中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1alpha,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,探讨HIF-1α、VEGF在缺氧条件下对舌鳞癌血管生成的作用机制及相互联系。方法:CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,MTT法检测细胞生长能力。荧光定量PCR,Western blot法分别检测不同缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达并进行相关性研究。结果:MTT发现CoCl2诱导的缺氧对细胞的生长起抑制作用。低氧条件下,Tca8113细胞HIF-1αmRNA水平稳定,蛋白表达显著升高,而VEGF mRNA和蛋白的表达均显著升高。结论:CoCl2诱导的缺氧使Tca8113细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并通过转录激活VEGF的表达,调控舌鳞癌的血管生成。     

环氧化酶-2抑制剂对舌癌细胞侵袭及基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的探讨环氧化酶-2（Cox-2）抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌细胞系Tca8113侵袭、黏附及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）分泌的影响。方法Tca8113细胞经塞来昔布作用24 h后,免疫组织化学方法检测细胞Cox-2蛋白表达,细胞外基质黏附实验检测细胞黏附力,Boyden侵袭小室测定细胞的侵袭力,酶联免疫吸附法检测培养液中MMP-2的水平。结果Tca8113细胞经塞来昔布作用24 h后,Cox-2蛋白表达明显受到抑制,Boyden侵袭小室细胞穿膜数和细胞外基质黏附率明显降低,同时,培养液中MMP-2水平也明显降低。结论Cox-2抑制剂塞来昔布可抑制Tca8113细胞Cox-2蛋白表达,其抑制细胞侵袭力和黏附率作用可能与抑制MMP-2分泌有关。     

间隙连接蛋白43在口腔颌面部鳞癌组织及舌癌细胞株(Tca8113)中表达的研究

目的:探讨间隙连接蛋白43(Cx43)在口腔鳞癌组织(oscc)和舌鳞癌细胞株(Tca8113)中的表达及其生物学行为的关系;细胞分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)对人舌鳞癌细胞株(Tca8113)中Cx43表达的影响。方法:应用免疫组织、细胞化学、免疫荧光及结合免疫印迹技术,观察OSCC组织中以及ATRA对Tca8113细胞株进行培养及分化诱导后Cx43在蛋白水平的变化。结果:Cx43在正常口腔鳞状上皮主要表达于相邻细胞间相互接触的细胞膜上,而在OSCC组织中,Cx43细胞膜表达与组织的分化程度、转移之间有显著性差异(Cx43:х2=7.42、12.43,P<0.05、P<0.01)。免疫细胞化学检测可见舌癌细胞中Cx43异常定位于细胞浆中和/或细胞膜不与邻近细胞接触的游离缘上。Tca8113经ATRA诱导后,Cx43蛋白表达增加。结论:Cx43表达的改变与OSCC的发生和发展有关。ATRA可以通过上调Cx43表达,实现对肿瘤生长的抑制     

银杏酸对口腔鳞癌多药耐药的影响

目的以卡铂（CBP）和平阳霉素（PYM）为诱导物,构建耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,再通过银杏酸（GAs）与化疗药物联用探讨银杏酸对耐药细胞多药耐药（MDR）的影响。方法免疫组织化学检测P-糖蛋白（P-gp）的表达,MTT法确定耐药细胞的耐药指数;不同质量浓度的GAs作用于耐药细胞及亲本细胞,通过MTT法检测对它们的增殖抑制效应,确定GAs的无细胞毒性质量浓度并观察GAs对耐药细胞的逆转作用;GAs与耐药细胞联用诱导细胞一段时间后,再次通过MTT法检测其耐药指数。结果免疫组织化学结果显示,耐药细胞的P-gp阳性表达率明显高于亲本细胞,MTT法确定GAs的无细胞毒性质量浓度为10 μg·mL-1;GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的逆转倍数分别是2.94和2.43,与GAs联用前Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药指数分别是3.24和11.9,联用后的耐药指数分别是2.18和4.43。结论本实验成功诱导出了耐药细胞株Tca8113/CBP和Tca8113/PYM,并将银杏酸与化疗药物联用,进一步证实了两者的共用能够增强对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的增殖抑制作用,无细胞毒质量浓度的GAs对Tca8113/CBP和Tca8113/PYM细胞的耐药性有部分逆转作用,且共用一段时间后耐药细胞的MDR水平有所下降。     

羟基喜树碱纳米微球抑制舌鳞癌Tca8113细胞的实验研究

目的探讨改良闭环羟基喜树碱（HCPT）药用剂型体外抑制口腔鳞癌细胞株的疗效。方法透析法制备载闭环羟基喜树碱/聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯（HCPT/PEG-PBLG）纳米微球,与HCPT羧酸钠盐分别作用于Tca8113细胞,对比观察细胞形态学改变,MTT检测细胞毒作用,流式细胞仪、DNA凝胶电泳检测细胞周期变化及细胞凋亡。结果成功制备HCPT/PEG-PBLG纳米微球,包封率56.8%;载药率7.5%。Tca8113细胞经HCPT和HCPT/PEG-PBLG分别作用后,显微镜形态学观察见细胞凋亡、生长抑制。MTT检测显示HCPT呈现明显细胞毒作用;HCPT纳米微球剂型组48h时生长抑制率低于HCPT普通剂型组（P≤0.01）,至96h时则与HCPT普通剂型组差异已无统计学意义（P〉0.05）。流式细胞仪、DNA凝胶电泳检测细胞周期发生变化：HCPT阻抑细胞于S期,同时诱导细胞凋亡;HCPT/PEG-PBLG组细胞周期与HCPT组改变类似,但S期阻抑增加速度平缓,慢于后者。结论HCPT对Tca8113细胞具有较强的抑瘤作用,阻抑细胞周期于S期并诱导细胞凋亡。HCPT纳米微球剂型具有药物缓释优点,体外实验作用平缓,终末抑瘤效果与HCPT羧酸钠盐剂型持平。     

塞来昔布对Tca8113细胞侵袭性影响的体外研究

目的:探讨环氧化酶-2(cyclooxygenease-2,COX-2)抑制剂——塞来昔布(celecoxib)对Tca8113细胞侵袭性的抑制作用。方法:用划痕实验检测Tca8113细胞的迁移能力;不同浓度的塞来昔布处理人舌鳞癌Tca8113细胞后,用MTT法检测细胞-基质黏附力的变化;用Transwell小室结合Matrix胶检测肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果:10、20μmol/L的塞来昔布作用24 h后,细胞的侵袭能力分别下降了54%和73%(P<0.001),细胞-基质黏附力也明显降低(P<0.001)。结论:Tca8113细胞是高侵袭性细胞,塞来昔布对Tca8113细胞侵袭的抑制作用呈剂量依赖性。