人MUCI/Y基因真核表达载体的构建及其在COS/7细胞中的表达

MUCl/Y是1994年发现的新基因,其蛋白锚定于细胞膜。研究表明,MUCl/Y具有膜受体的特征,可能作为一种膜表面的重要分子通过ras信号传导通路参与细胞的恶性转化过程;进一步的动物实验表明,MUCl/Y的表达具有肿瘤特异性。由此推测,MUCl/Y可能是一种肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子,但迄今为止,MUCl/Y基因及其编码蛋白的功能尚未明确,因此,构建人MUCl/Y全长cDNA的真核表达载体,将对进一步研究该基因的功能以及以MUCl/Y为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备,具有重要意义。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4（Par-4）基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Par-4,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞总蛋白,Western blotting检测Par-4表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Par-4载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达。结论　pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

HSV1-tk报告基因真核表达载体的构建及其在人肺腺癌AGZY细胞中的表达

目的：构建含有HSV1-tk（ Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, HSV1-tk）基因的真核表达载体,并检测其在人肺腺癌AGZY细胞系中的表达。方法应用PCR反应从质粒pHSV106质粒中扩增HSV1-tk基因后与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pHSV1-tk/18T。将测序正确的重组质粒插入plRES2-EGFP 载体内,通过LipofectamineTM 2000将表达载体转染人肺腺癌AGZY细胞。结果酶切鉴定结果表明扩增的HSV1-tk基因序列正确;用荧光显微镜观察HSV1-tk基因的转入和表达;RT-PCR和Western blot结果显示在AGZY细胞中HSV1-tk基因在转录水平和蛋白水平均可以正确表达。MTT结果显示转染后AGZY细胞与未转染细胞在细胞增殖能力方面无明显差别。结论成功构建HSV1-tk报告基因的真核表达载体,在人肺腺癌AGZY细胞中能有效表达。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆血管内皮生长因子C（Vascular Endothelial Growth Factor C）功能片段的cDNA，构建人VEGF-C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C在宫颈癌中表达的意义及在淋巴管生长及转移中的作用。方法：根据人VEGF—CcDNA序列，设计合成二对特异性引物，第一对5’端含有EcoR Ⅰ及第二对3’端含有XhoI酶切位点。运用RT—PCR法克隆人MDA—MB231中的VEGF—C cDNA部分编码序列（CDS）：经双酶切后将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5d中扩增，纯化。通过PCR和双酶切鉴定阳性重组子及进行基因序列的测定。结果：用RT—PCR克隆到VEGF—CcDNA部分CDS；PCR和双酶切鉴定阳性重组子，显示有人VEGF—C cDNA编码序列，基因序列测定显示重组质粒上插入的人VEGF—C序列正确。结论：从富含VEGF—C的人MDA—MB231细胞系中克隆得到的VEGF—C基因功能片段cDNA．成功构建了人真核表达栽体pcDNA3．1（＋）／VEGF-C。     

T细胞淋巴瘤TCRγV1重排基因真核表达载体的构建

目的构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒.方法用PCR法扩增含XbaI与BglII酶切位点的TCRγV1基因序列,对VR1012载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α,对重组质粒经序列测定,称VR1012/TCRγ.结果已构建的质粒VR1012/TCRγ经序列测定含有完整的TCRγV1基因片段.结论 VR1012/TCRγ表达载体的构建为基因治疗淋巴瘤奠定了基础.     

MDR1基因全长序列真核表达载体的构建

目的构建MDR1基因全长序列真核表达栽体.方法采用PCR技术,扩增MDR1基因全长序列,并定向克隆入pcDNA3.1(+)质粒载体CMV启动子序列下游的BamH I和Xho I限制性内切酶酶切位点之间.结果重组体经转化E.ColiJM109后可大量扩增,提取该重组体进行限制性内切酶酶切分析,可见预期的目的片段和载体片段,并且以重组体为模板,用特异性引物可扩增出MDR1基因的1kb片段.结论成功地构建了MDR1基因全长序列真核表达载体,为进一步探讨MDR1基因表达产物的生物学活性以及临床检测、治疗等应用提供实验依据.     

T细胞淋巴瘤TCRγV1重排基因真核表达载体的构建

目的　构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒。方法　用PCR法扩增含XbaI与BglII酶切位点的TCRγV1基因序列 ,对VR10 12载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切 ,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α ,对重组质粒经序列测定 ,称VR10 12 /TCRγ。结果　已构建的质粒VR10 12 /TCRγ经序列测定含有完整的TCRγV1基因片段。结论　VR10 12 /TCRγ表达载体的构建为基因治疗淋巴瘤奠定了基础。     

Fas siRNA真核表达载体构建及其抑制Jurkat细胞凋亡的作用

 目的 构建Fas（CD95）特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,转染Fas-FasL凋亡敏感细胞株Jurkat,研究其抗凋亡作用。方法 通过聚合酶链式反应（PCR）制备siRNA表达框架(SECs),转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA抑制率,筛选出高效抑制Fas mRNA表达的siRNA;把筛选出的siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建psilencircle-FasSi;psilecircle FasSi转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA、Western blot检测Fas蛋白;anti-Fas mAb刺激Jurkat细胞凋亡,流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡率。结果 酶切、测序证明成功构建了psilecircle-FasSi,实时荧光定量PCR及Western blot表明psilencircle-FasSi可抑制Fas mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测证实psilencircle-FasSi可抑制Jurkat凋亡率。结论 我们成功构建了Fas特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,它不仅可以下调Jurkat细胞的Fas表达而且可以显著抑制Fas-FasL途径诱导的凋亡。     

ECM1-pEGFP-N2 真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2,检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法,以ECMleDNA为模板,扩增出ECM1基因,用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体,连接酶切目的片段,转化大肠杆菌DH5,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定;利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因;PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体;转染MCF-7细胞后,可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光,用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体,并在MCF-7细胞中表达,为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达

[目的]构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况。[方法1根据Genebank数据库提供的人Egr—1启动子基因序列,设计-对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆。RT—PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MVX线照射对CD基因表达的影响。f结果1经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3．1（＋）-Egr．1．CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT—PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高,尤以15Gy组CDmRNA的表达水平最高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降。[结论]pcDNA3．1（＋）-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株．建立了基因表达与放射的剂量效应关系．为后续的临床应用研究奠定基础．     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

人细胞周期素D1和B1真核表达载体的构建及对HeLa细胞的转染

目的：构建人细胞周期素cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,并将其瞬时转染到HeLa细胞株中。方法：以HeLa细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增cyclin D1和cyclin B1基因编码的cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMV~（TM）-14真核表达载体,分别构建p3XFLAG-cyclin D1和p3XFLAG-cyclin B1重组质粒,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测细胞中FLAG融合蛋白的表达。结果：经酶切鉴定和Western印迹分析证实人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达分子量大小相符的重组蛋白。结论：成功构建了人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,为两种细胞周期素及其相关蛋白的功能研究奠定了基础。     

TSLC1基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

Objective： To construct the eukaryotic expression vector for human TSLC1 gene, and to express TSLC1 in HepG2 cells for investigating its effect on HepG2 cell growth. Methods： Full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver by RT-PCR, and cloned into pCI-neo expression vector. The recombinant plasmid pCI-TSLC1 was identified with restriction enzyme and sequenced, and then was stably transfected into HepG2 cells with lipofectamine 2000. The positive clones were examined by western-blotting and immunofluorescence, cell growth was analyzed with MTT assay. Results： The eukaryotic expression vector pCI-TSLC1 was successfully constructed and the stable cell line highly expressing TSLC1 protein was obtained. The growth of TSLCl-transfected cells was significantly suppressed in vitro. Conclusion： The HepG2 stable cell line could highly express TSLC1 protein, which provided a basis for further exploring the roles of TSLC1 in hepatocellular carcinoma.     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

突变型自杀基因HSV1-sr39tk真核表达载体的构建与鉴定

 目的 克隆突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV1-sr39tk并构建其真核表达载体。方法 通过PCR扩增HSV1-sr39tk基因,用BamHⅠ和BglⅡ双酶切纯化的PCR产物,在T4DNA连接酶作用下于室温将其连接于经BamHⅠ单酶切的慢病毒载体转移质粒pTK151上,重组质粒经PstⅠ酶切及测序鉴定。结果 阳性重组质粒酶切及测序鉴定与预期结果完全相符。结论 成功克隆出突变型自杀基因HSV1-sr39tk,并成功构建其真核表达载体。