脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.     

大黄素诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:探讨大黄素对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的影响.方法:体外分离、培养及扩增入骨髓MSCs,用流式细胞仪检测人骨髓MSCs表面抗原的表达,用倒置光学显微镜、透射电镜、四甲基偶氮唑盐比色、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定等研究人骨髓MSCs增殖和分化规律.采用不同方法诱导第3代人骨髓MSCs向成骨细胞分化.结果:入骨髓MSCs贴壁生长,呈成纤维细胞外观.流式细胞仪检测显示CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达为阴性.大黄素对入骨髓MSCs增殖的影响:对照组和DXM(地塞米松)组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.05).大黄素对人骨髓MSCs分化的影响:对照组和DXM组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.01).结论:大黄素能促进入骨髓MSCs向成骨细胞方向分化.     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

骨髓间充质干细胞及其诱导成骨的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织[1],如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力[2-3],这些细胞经过20～30个培养周期,仍能保持多向分化潜能。无论是自体的还是同种异源的BMSCs,一般都不会引起宿主的免疫反应。BMSCs以其来源充足、取材简便、对供体损伤小、易于分离培养、体外增殖能…     

体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达。方法选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15ml。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值。将第1代细胞置于含1×10-8mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组。分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达。结果原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆。细胞在培养后12～14d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13。MSCs成骨分化:诱导培养14d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样。培养5d,对照组细胞计数为11723±4040,实验组为10276±5513,二者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组诱导培养14d,ALP染色呈强阳性,21d钙沉积明显增加(P<0.01)。实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)、osterix、ALP、型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P<0.05);第14天,型胶原表达也上调(P<0.05)。结论密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞旁分泌对成骨细胞生物学活性的影响

目的 探讨在骨修复中骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)旁分泌对成骨细胞生物活性的作用与影响.方法 研究通过transwell对BMSCs与类成骨细胞MG63行非接触性共培养方法,排除BMSCs成骨分化的影响,单纯观察BMSCs旁分泌对MG63细胞生物学特性的改变.应用...     

体外培养的人脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的:了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力.方法:体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数,行成骨和成脂诱导,流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子.结果:人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106,而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G 2/M所占比例分别为79.1%、19.7%和1.3%.分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化.结论:脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点,体外能够向成骨和成脂方向分化.     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的探讨将成人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定. 方法分离人骨髓,梯度离心并结合全骨髓法进行培养,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸.贴壁细胞传代,取第3代细胞鉴定其成骨特性;在倒置相差显微镜下观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达,原位杂交检测骨连接素(ON)、骨桥素(OP)表达,Von Kossa 染色检测钙结节形成. 结果第3代人MSCs呈典型的成骨细胞形态,可连续传代10次;ALP染色阳性率达85%;Ⅰ型胶原、ON和OP表达阳性;Von Kossa 染色可见钙结节形成. 结论成功地将人MSCs诱导分化为成骨细胞,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性.     

脐血间充质干细胞的培养鉴定及成骨诱导后的免疫原性研究

目的通过观察体外培养人脐血间充质干细胞(Umbilical cord blood-mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)并作诱导成骨分化,探讨其作为组织工程的骨种子细胞的可行性。方法体外分离培养UCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达及其变化规律;体外成骨诱导UCB-MSCs2周,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量测定的方法评价细胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs细胞,流式细胞仪检测加入IFN-γ前后的HLA-Ι、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表达情况;流式细胞仪检测UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况以观察成骨诱导分化的MSCs免疫抗原性的变化。结果第1、3、5代细胞的CD29、CD105和CD166均呈阳性表达,而造血细胞系的表面标记CD31、CD34和CD45则呈低表达,且随传代次数增加含量逐渐下降。UCB-MSCs成骨诱导2周后,Alizarin Red染色为阳性。对照组则无明显钙盐沉积。钙离子半定量的检测结果则表明,UCB-MSCs成骨诱导2周后的钙离子含量远高于未诱导组。流式细胞检测结果显示,人UCB-MSCs高表达HLA-Ι类分子,不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40,CD80等共刺激分子;经IFN-γ刺激诱导后,HLA-Ι类分子的表达未发生改变,HLA-Ⅱ类分子呈阳性表达,而CD40和CD80的表达仍为阴性。人UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子均为阳性表达;而HLA-Ⅱ类分子在成骨分化前为阴性,诱导后阳性表达率增高。结论①UCB-MSCs能诱导分化为成骨细胞,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞;②成骨分化使UCB-MSCs的免疫原性发生相应变化。     

人脐带间充质干细胞用于衰老相关疾病治疗的研究进展

随着干细胞移植技术的发展,通过输入干细胞进行抗衰老治疗或治疗退行性疾病成为人们研究的热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)是一种存在于脐带沃顿胶以及血管周围组织中的独特前体细胞,具有自我更新和多向分化潜能。目前大量科学研究显示HUCMSCs通过再生和修复衰老的细胞、组织和器官达到抗衰老作用。该文对HUCMSCs的生物学特性、组织再生修复作用和抗衰老治疗机制的研究进展进行了详细回顾,并对目前HUCMSCs临床前研究现况进行了总结,提示HUCMSCs是一种具有良好应用潜力和价值的干细胞类型。     

淫羊藿苷诱导人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的实验研究

目的 研究淫羊藿苷对脐带间充质干细胞的生物学作用,以及诱导其向成骨细胞分化.方法体外分离、培养及扩增人脐带间充质干细胞,免疫组化技术检测人脐带间充质干细胞(huCMSCs)表面特异标志物表达.取第3代细胞,设立2组,空白对照组加入基础培养基,实验组加入淫羊藿苷诱导.用倒置光学显微镜、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定细胞.进行对比,研究人脐带间充质干细胞增殖和分化规律.结果 免疫组化结果显示huCMSCs表面标记CD44、CD34阴性,检测结果符合huCMSCs的特征.随着培养天数的增加,淫羊藿苷组诱导后细胞液中成骨细胞特征性碱性磷酸酶强阳性表达及钙沉积.淫羊藿苷组细胞内ALP含量与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 huCMSCs可以在体外采用组织块贴壁培养法培养成功,淫羊藿苷对人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化具有促进作用,可作为骨性诱导因子.

Abstract：

Objective To study the biological effect of Icariine on human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(huCMSCs) and inducing them to differentiate into osteoblasts. Methods MSCs were isolated and expanded in vitro and their surface antigens of huCMSCs were detected by immunohistochemistry. HuCMSCs were assigned into two groups. In the blank control group, huMSCs were incubated in basic medium. In the experimental group huMSCs were incubated in Icariine medium, The proliferation and differentiation of huMSCs were examined by inverted microscope, Alkaline phosphatase (ALP) staining and the determination of ALP activities. Results HuCMSCs were strongly positive for CD44, and negative for CD34; strongly positive expression for ALP and calcium deposition was detected from the second day to the fourth day in Icariine group; blank control group and Icariine group had significant differences (P ＜ 0.05).Conclusion HuCMSCs can be successfully cultured from the adherent tissue pieces, Icariine enhances proliferation and osteogenic differentiation of huCMSCs and be used as an osteoinductive factor.     

Cultured human epithelium: human umbilical cord blood stem cells differentiate into keratinocytes under in vitro conditions

BACKGROUND: Stem cells have the capacity to renew or to give rise to a specialized cell types. Human umbilical cord blood (HUCB) has been explored as an alternative source of stem cells. However, its potential to differentiate into cells of other tissues is still under discussion. The aim of our study was to evaluate if HUCB stem cells could differentiate into epithelial cells under in vitro conditions. METHODS: Human keratinocytes derived from adult female skin donors, were isolated and cultured on fibrin glue/fibroblast gels-control group. In the umbilical cord blood cell group, male umbilical cord blood cells were added at a 1:10 ratio to keratinocytes and co-cultured on the fibrin glue/fibroblasts gel. After 15 days of culture, the sheets were analyzed by use of histochemistry and FISH. DNA was extracted and evaluated by use of polymerase chain reaction (PCR) for detection of Y-chromosome-specific sequences. RESULTS: In both groups a regular epithelial sheet consisting of three to four layers of cells was formed. Using PCR and FISH, in the umbilical cord blood cell group the presence of Y-chromosome-specific sequences in the cultured keratinocytes could be detected. In the control group, no Y-chromosome-specific sequences could be detected. CONCLUSION: Our findings indicate that umbilical cord blood stem cells differentiate into epithelial cells under in vitro conditions and thereby, might serve as a starting material for isolation and expansion of cells for transplantation in patients with large skin defects.     

人脐带间充质干细胞改善小鼠下肢缺血机制的代谢组学分析

背景与目的：外周血管疾病（PAD）是因各种原因所致血流灌注不足而引发的疾病,部分患者无法手术。近年来,干细胞移植开始应用于PAD的治疗,并取得了一定的效果。然而目前尚未见其作用机制涉及代谢方面的研究。因此,本研究利用液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学初步探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSC）促进下肢缺血组织修复中所涉及的代谢通路与代谢分子,并重点分析酸性鞘磷脂酶（ASM）-神经酰胺（Cer）代谢途径的变化。方法：从人脐带组织中分离获得HUCMSC,培养扩增后用流式细胞术鉴定其表面分子标记。8周龄雄性小鼠（C57BL/6J）采用结扎并离断其左侧下肢股动脉、股静脉的方法制备下肢缺血模型,将造模后的小鼠随机均分为两组,分别于缺血侧下肢局部注射HUCMSC混悬液（HUCMSC组）与PBS （对照组）。分别在术后3、7、14 d,取两组小鼠缺血侧腓肠肌组织,行HE染色与Masson染色,观察两组小鼠缺血肌肉的形态学变化;行LC-MS检测,并结合KEGG数据库分析,比较两组肌肉组织的代谢组学差异。结果：分离获得的HUCMSC高表达CD105、CD90、CD73,低表达HLA-DR、CD14、CD...     

脐血间充质干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血的影响

目的　从人脐血中分离纯化间充质干细胞(MSC) ,观察其移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能恢复的影响及细胞的存活、迁移向神经细胞分化的情况。方法　雄性SD大鼠45只,用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,大鼠随机分为3组:MSC移植组、单核细胞组和生理盐水组。移植后1、7、14、2 1、2 8d采用改良神经功能损害评分(mNSS)观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫组织化学和免疫荧光双标记技术检测5溴 2脱氧尿核苷(BrdU )标记的MSC细胞的存活、迁移及其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性核蛋白(NeuN)的表达。结果　人脐血MSC细胞移植可显著提高大鼠局灶性脑缺血后神经功能的恢复(P <0 .0 5 )。移植的MSC细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移,11.67%MSC细胞表达GFAP ,3 .72 %MSC细胞表达NeuN。结论　人脐血中含有MSC细胞并可促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复,移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化     

脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化后的表型变化

目的：比较人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向汗腺样细胞诱导前后表型特征的变化.方法：对hUC-MSCs进行分离、培养、鉴定,通过显微镜观察、免疫细胞化学、流式细胞术等方法比较hUC-MSCs经汗腺分化诱导培养液培养前后细胞形态变化及癌胚抗原（CEA）、角蛋白7（CK7）、CK8、CK14、CK18、CK19表达的差异.结果：hUC-MSCs向汗腺样细胞诱导前呈梭形,呈成纤维细胞样;流式细胞仪检测发现CD29、CD90表达阳性;而CD34、CEA、CK14、CK19表达阴性.经汗腺诱导培养基诱导后hUC-MSCs分化为外形肥大、不规则、类似铺路石样的细胞,聚集性增殖;免疫细胞化学检测显示CK7、CK8、CK18抗原表达阳性;流式细胞仪检测结果显示CEA、CK14、CK19的阳性表达率分别为77.98%,48.47%,20.85%.结论：hUC-MSCs经过汗腺分化诱导培养基培养后能够分化为表达汗腺细胞标记物抗原的汗腺样细胞.     

黄芪诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的实验研究

目的 研究原代人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其体外向神经细胞诱导分化的条件,为组织化人工神经的制备提供干细胞资源.方法 无菌条件下从人脐带华尔通胶(Wharton jelly)分离并贴壁培养人UCMSCs,免疫组化技术检测UCMSCs表面特异标志物表达;四组细胞分别加入单纯培养液空白对照组(A组)、单纯生长因子诱导组(B组)、单纯黄芪诱导组(C组)和黄芪联合生长因子诱导液(D组),倒置显微镜下观察其形态并检测NSE、NF和GFAP的阳性表达,结果进行统计学分析.结果 人UCMSCs表面标记CD29、CD44、CD105强阳性,CD106弱阳性,CD34、CD45阴性,符合人UCMSCs的特征;人UCMSCs经黄芪诱导后细胞表面GFAP、NSE均为强阳性表达.结论 人UCMSCs可以在体外采用组织块贴壁培养法培养成功,黄芪可将人UCMSCs成功的诱导为神经样细胞,为组织化人工神经的制备和周围神经缺损的治疗提供了新的方法.

Abstract：

Objective To investigate the biological characteristics of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(UCMSCs) and inducing them to differentiate into neurons in vitro,in order to provide stem cell resource for the tissue engineering artificial nerve. Methods UCMSCs were cultured from Wharton jelly of human umbilical cord in the condition of sterilitas,surface antigens of UCMSCs were detected by immunohistochemistry.The frist group of cells were added by virgin nutrient,the second group of cells were induced by merely growth factors,the third of cells were induced by merely astragalus mongholicus and the fourth by the astragalus mongholicus with growth factor,observed the morphology of the cells of the two groups under inverted microscope,and determine the positive expression rate of nerve cells' markers,such as NSE,NF and GFAP.The results were statistically analyzed.Results UCMSCs were strongly positive for CD29,CD44,CD105,weakly positive for CD105 and negative for CD34,CD45.After induced by Astragalus mongholicus,UCMSCs were strongly positive for GFAP,NSE. Conclusion UCMSCs can be successfully cultured from the adherent tissue pieces,Astragalus mongholicus can successfully induce them to differentiate into neurons in vitro,to provide a new method of making the tissue engineering artificial nerve and treat theperipheraly nervus defect.     

人脐血间充质干细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

目的 评价用人脐血间充质干细胞(HUCBMSCs)构建组织工程化人工神经修复大鼠坐骨神经10 mm缺损的治疗效果. 方法 用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM进行培养获得MSCs.30只SD大鼠随机分为3组,每组10只.A组:将HUCBMSCs与生物蛋白胶混合,种植于羊膜管中修复坐骨神经缺损;B组:仅将生物蛋白胶种植于羊膜管中:C组:坐骨神经切下后再将其缝合.9周后,行大体观察、坐骨神经功能指数、腓肠肌湿重测定、组织学染色,S100免疫组化染色等检查. 结果 32份脐血18份可培养出MSCs,但传代培养大量扩增只有4份.HUCBMSCs植人手术后9周检查结果显示,坐骨神经功能指数、腓肠肌湿重测定A组(-64.2234±2.9461、41.29524±3.88421)优于B组(-74.5882±3.3298、28.34097±3.42889),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 人脐血中含有MSCs并且能够分离培养扩增,HUCBMSCs能够促进大鼠坐骨神经损伤的神经再生.