3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的灵敏度和特异性,初步探讨其用于乙肝病毒检测的临床价值。 方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎病人及30例阴性参比血清标本中的HBV,以荧光定量PCR结果为标准,比较三种试剂检测灵敏度和特异性。结果 3种试剂盒的HBV检出率分别为93.3%（28/30）、96.7%（29/30）、100%（30/30）;3种试剂检测HBV的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/ml,B、C公司均为102 IU/ml。结论 本研究使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV快速检测。     

临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值.方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度.结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL.结论 使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测.     

荧光探针结合区序列突变对HBV DNA检测的影响

目的探讨标本荧光探针结合区序列突变对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响。方法采用3种国产荧光定量PCR试剂对200例标本进行平行检测HBV DNA,分析3种试剂检测结果的差异,并对6例3种试剂检测结果无差异的标本和6例达安试剂检测结果明显降低或漏检标本进行测序。结果 3种试剂检测结果相差30倍以上的标本47例,且3种试剂均有不同程度的漏检;6例3种试剂检测结果无差异的标本荧光探针结合区序列无突变,6例达安试剂检测结果明显降低或漏检的标本荧光探针结合区序列均有突变。结论标本荧光探针结合区序列突变是造成达安试剂检测HBV DNA结果明显降低或漏检的原因。     

应用分子信标荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒核酸的评价

目的：分子信标(Molecular Beacon)是近年新发展的一种荧光标记发夹形寡核苷酸探针。本目的在于对国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒(厦门泰伦生物工程有限公司的“乙型肝炎病毒荧光PCR定量检测试剂盒”)的主要性能进行评价。方法：以Roche公司的乙型肝炎病毒(HVB)定量检测试剂盒AMPLICOR HBV MONITOR^TM Test Kit为参比,对分子信标定量检测临床血清标本HBV DNA的结果,进行比较和分析。结果：根据两种试剂盒定量检测34份乙型肝炎和非肝炎血清及一份系列10倍稀释血清(含高水平HBV DNA)的数据,并以Roche试剂盒的结果为参比标准,分子信标试剂盒定量检测HBV DNA的相对敏感性、特异性和符合率均为100％(分别为：19／19,15／15和34/34);其定量检测HBV DNA的线性范围和下限分别为10^3～10^3copies/ml和10^3copies/ml;两种试剂盒定量检测HVB DNA的相关系数(r)＝0．987。结论：初步结果表明：该国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒的主要性能,与Roche公司的AMPLICOR HBV MONITOR^TM Test试剂盒相似,并具有较后更宽的线性定量范围。     

HCV RNA定量检测试剂的临床应用

目的:探讨HCV RNA定量检测试剂的临床应用效果。方法:通过和市场上广泛使用的柱提取试剂比实验,对一种丙型肝炎病毒磁珠法核酸提取荧光定量PCR检测试剂的临床使用进行评估。结果:①浓度在5.00E+03～5.00E+06 IU/mL的样本,两种试剂的定量结果与理论靶值均具有很好的对应性,具有较好的重复性和精密度;对于1.00E+03IU/mL以下的样本,磁珠法的定量结果重复性好,定量准确;而柱提取法大部分均未能检出。②对于2种方法检测的339例临床样本,中高病毒载量组柱提取法检测>5.00E+02IU/mL有147例,两种试剂定量结果基本一致,相关性r为0.9413。3 339例临床血清样本中5例样本磁珠法检测为阳性,而柱提取法检测为阴性,P<0.01,二者有显著性差异。这5例样本,丙肝肝炎抗体检测均为阳性。结论:①对于中高病毒载量的样本,两种试剂均具有良好的检测效果;②磁珠法对比柱提取法在低病毒载量区域,灵敏度更高,同时操作相对简单,不易出现污染与脱靶,具有较高的临床应用价值。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

HCV及HIV二联病毒核酸荧光PCR检测方法的建立

目的建立多联病毒核酸荧光PCR检测方法,为我国核酸检测技术的应用前景提供技术支持。方法使用逆转录实时荧光PCR定量方法（QRT。PCR）检测HCV、HIV病毒,在成功扩增定量单一病毒的基础上,通过主要调整Mg2＋离子、dNTPs、Taq的浓度等优化反应体系,建立同时检测两种病毒核酸的逆转录实时荧光PCR定量检测方法（一步法双检）,并分析双检体系的扩增灵敏度。结果通过优化筛选反应条件,使用QRT．PCR方法成功扩增双模板HCV／HIVRNA,且检测特异性好,灵敏度较高,能达到HCVRNA20IU／ml与HIVRNA80IU／ml的检测灵敏度。结论本试验成功建立能同时检测两种病毒核酸的QRT．PCR方法,为后续研究HBV、HCV、HIV多联荧光病毒核酸检测系统提供了理论依据与技术支持。     

甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较

目的 比较本实验室内部建立的甲型肝炎病毒核酸定量体系和另外两个商品化实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测效果.方法 本实验室内部建立的HAV核酸检测系统选取HAV基因组的高保守区段5 ′非编码区作为扩增靶点,定量标准品采用体外转录获得的RNA分子,HAV疫苗株储存液倍比稀释成10-8 ～ 10-1后提取RNA作为模板用以比较该反应体系与市售商品化试剂盒的准确性、灵敏度以及特异性.结果 本实验室内部建立的HAV核酸检测体系十分适宜于HAV的检测,最低检测极限达到10 TCID50/ml,比国内某厂商生产的HAV定量PCR检测试剂要灵敏,然而Qiagen公司的RealArt HAV LC RT-PCR检测试剂效果最好,其检测极限可以达到5 TCID50/ml.结论 本实验室内部建立的HAV核酸定量体系可重复性好,敏感度高,特异性强,在临床样本,环境样本以及食品样本的检测方面具有广阔的应用前景.     

乙型肝炎病毒核酸定量检测中不确定度的研究

目的研究应用实时荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR）开展乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus,HBV）核酸定量检测中的测量不确定度。方法通过实时荧光定量PCR进行乙型肝炎病毒核酸定量检测的实验分组设计与数据处理分析,计算分析该检测方法不同来源的测量不确定度值。结果对3组不同水平浓度值样本来源的数据采用两种方法进行统计分析,QDNA的组标准差远远大于LGQDNA的标准差,初始浓度数值经过对数转化后离散程度降低,统计平均值也发生了偏离。LGQDNA为3.465、4.927和6.018的样本,其浓缩过程来源的相对不确定度分别为0.020、0.019和0.009;LGQ无偏估计在3.706、6.750的样本的核酸提取来源相对不确定度分别为0.016和0.009;数据分析来源的LGQ不确定度为0.000～0.008;热循环仪来源的LGQ不确定度为0.002～0.008。结论使用核酸浓度值QDNA与使用其对数值LGQDNA进行数据统计分析的结果存在差异;标本制备过程中的浓缩和DNA提取是实时荧光定量PCR进行HBV核酸定量检测时测量不确定度的重要来源,标本制备环节是影响该项检测的关键因素,包括试剂、方法和操作者的准确操作能力。     

实时荧光PCR法快速检测急性上呼吸道感染病原体

【目的】利用实时荧光定量PCR技术,建立一套快速可靠的急性上呼吸道感染病毒/细菌检测方法,对杭州市某学校暴发的一起群体性急性上呼吸道感染进行病原学分析。【方法】用甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒、呼吸道合胞病毒核酸测定试剂盒、腺病毒核酸测定试剂盒、B型流感嗜血杆菌核酸测定试剂盒对20例上呼吸道感染疑似患者样品进行实时荧光定量PCR检测。【结果】20例样本中有7例为腺病毒病毒阳性,无其它病毒或细菌阳性。【结论】实时荧光定量PCR法能快速准确地检测急性上呼吸道感染的病原体;本次暴发的急性上呼吸道感染是由腺病毒病毒引起的。     

复方叶下珠胶囊体外抗乙型肝炎病毒作用的研究

目的研究复方叶下珠胶囊的体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法将HepG2.2.15细胞分为空白对照组、阳性对照组和不同浓度的复方叶下珠胶囊组,用CCK-8检测细胞毒性,酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg和HBeAg;荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞内、外的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）。结果复方叶下珠胶囊有明显的抗HBV作用,尤其当浓度为50mg/mL时,减少血清中的HB-sAg作用与拉米夫定组相当;当浓度为25 mg/mL,50mg/mL,和100mg/mL时,减少血清中HBeAg作用优于拉米夫定组;但是降低细胞内外的HBV DNA含量方面,与拉米夫定组无明显差别。结论体外试验中,复方叶下珠胶囊具有抗HBV作用。     

HBV-DNA高水平孕妇的HBV 前S和S区基因突变及基因分型

 【目的】 研究HBV-DNA高水平孕妇的HBV前S(前S1和前S2)及S区的基因突变模式和基因分型,为从病毒因素探讨HBV母婴传播免疫阻断失败提供实验基础。【方法】 选取血清HBsAg阳性且HBV-DNA≥105 IU/ mL的孕妇41 例,提取血清HBV-DNA,靶向设计HBV各基因型的前S及S区通用引物, 经PCR 扩增测序进行序列分析, 检测和分析前S及S区基因的突变情况,并进行基因分型。【结果】 ①在 41 例样本中, 共有29例( 70.73%)样本存在前S1、前S2及S区基因突变,突变方式以碱基置换为主;前S1、前S2及S区基因的突变频率分别为8.96%、9.88%和3.24%,前S1和前S2区的突变频率显著高于S区(P < 0.05)。②对41例样本根据S区点突变的特点进行基因分型及同源树簇集分析,结果B基因型22例,C基因型19例,两基因型在全S区的基因突变频率相比,差异无统计学意义(P > 0.05);B、C两基因型分别形成独立的簇集,簇集间同源性<90%,但簇集内B、C两个基因型的同源性分别达96%和95%。【结论】 ①HBV-DNA高水平孕妇的HBV 前S及S区的基因突变普遍存在,突变形式以碱基置换为主,突变频率以前S1和前S2区常见,S区则相对稳定;②不同HBV基因型间同源性差异较大,按HBV不同基因型分别进行前S和S区基因突变模式的分析将更有意义。     

桂林地区乙肝患者HBV基因型分布及S基因变异研究

目的研究桂林地区HBV基因型分布、S基因突变类型以及基因型与乙肝患者血清标志物、DNA载量和S基因突变位点的相关性。方法用巢式PCR方法扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,构建系统树进行基因分型,分析S基因的突变位点并通过对相关氨基酸的分析判断血清型,采用t检验和χ2检验统计分析相关性。结果 84例乙肝患者HBV基因型有B型(59.5%)、C型(40.5%)。B基因型中的血清型有adw1型(84%)、ayw1型(4%)、adrq+型(10%)。C基因型中有adrq+型(88.2%),adw1型(8.8%)。S基因突变位点主要为T126I和T143M/S,突变率分别达34.1%和40.0%。基因型与患者年龄及DNA载量具相关性(P<0.05),与乙肝患者血清标志物及S基因突变位点无相关性(P>0.05)。结论桂林地区HBV基因型主要为B型,其次为C型。血清型主要为adw1型和adrq+型。S基因变异点集中,有形成优势变异株的趋势。     

肝康颗粒的药效学研究

目的该实验旨在观察中药复方剂肝康颗粒体外抗乙型肝炎病毒及其药效学。方法利用HepG2.2.15细胞模型,采用MTT法和细胞凋亡染色实验来检测肝康颗粒的细胞毒性,并观察其量-效关系;通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测乙肝病毒HBV中HBsAg和HBeAg的表达,并用荧光定量PCR技术定量分析HBV DNA的复制浓度。结果 MTT法检测结果发现随着浓度和时间的增加,对HepG 2.2.15细胞生长抑制作用明显增强。ELISA法测定加药后HBV病毒分泌到上清液中的HBsAg和HBeAg含量,可见随着浓度的增大,对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用增加,并且抑制效果随着作用时间的累加也相应增强。GKKL抑制HBV病毒分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数值TI均大于2,结果显示药物低毒高效,具有很好的安全性。实时荧光定量PCR法检测发现,与对照组相比较,肝康颗粒对HBV DNA具有显著的抑制作用,均可使细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低(P<0.05,P<0.01)。且随着浓度和作用时间的增加其作用逐渐增强,呈现一个明显的量效和时效反应关系。结论由此证明肝康颗粒具有降低HBsAg和HBeAg,抑制HBV DNA复制的明显作用,将为进一步药理毒理研究提供实验基础。     

联合检测端粒酶活性、CEA、ADA对诊断与鉴别良恶性胸水的价值

目的 探讨端粒酶活性、CEA、ADA检测对诊断与鉴别良恶性胸水的价值.方法 51例胸水患者经胸水常规细胞学检查,同时用TRAP-PCR-ELISA法对胸水中脱落细胞进行端粒酶活性检测,电化学发光免疫法和氨试剂法测定胸水CEA、ADA.结果 51例胸水患者中12例肺癌胸膜转移,2例乳腺癌胸膜转移,1例脓胸,1例结核性胸膜炎端粒酶活性表达阳性.20例恶性胸水的端粒酶活性水平平均A值、CEA、ADA分别为( 0.980±0.333)、( 45.3±13.3)ng/mL和(11.8±4.0) IU/L,31例良性胸水的端粒酶活性水平平均A值、CEA、A-DA分别为(0.110±0.081)、(3.6±1.2 )ng/mL和(49.8±10.5 )IU/L(P ＜0.001).20例恶性胸水细胞学阳性率45％(9/20),端粒酶活性阳性率70％( 14/20)、特异性93.5％,胸水端粒酶活性、CEA、ADA三项联合检测敏感性和特异性,可分别达95.0％和100％.结论 端粒酶的激活可作为肿瘤的一种生物学特性,在诊断与鉴别良恶性胸水中具有重要的价值,但存在假阴性和假阳性,若与胸水CEA、ADA联合检测对良恶性胸水鉴别诊断意义更大.     

浙江省农村自然人群隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）情况及进化特征分析

 【摘要】目的 了解浙江省德清县农村一般人群隐匿性及实际乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染情况及病毒株S基因的分子特征。方法 采用多级抽样方法进行横断面调查,在取得调查对象知情同意的基础上采集调查表信息并采血。采用Epidata 3.2软件录入调查表信息,双录入并核对;采用SPSS 18.0软件进行数据分析;对所有样品进行乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg) ELISA检测及病毒载量real time PCR测定,并对HBsAg检测阳性或病毒载量测定阳性的标本进行后续HBV S基因PCR扩增和测序;采用MEGA 5.0软件对测得序列进行进化分析。结果 共调查对象1 720例,调查人群中HBsAg阳性者共162例,隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)者共4例,实际HBV感染率为9.65% (166/1 720),OBI感染率为2.57‰ (4/1 558)。显性和隐匿性病毒株病毒载量中位数及四分位数范围分别为866 (425,12 500)IU/mL和314 (216,677.5)IU/mL,前者显著高于后者。HBsAg阳性血清样本扩增得到71株显性病毒株S基因序列,HBsAg阴性血清样本扩增得到4株OBI病毒株S基因序列。OBI病毒株均为C基因型,adrq+血清型。显性HBV病毒株54株为B基因型,其中有2例标本为adw3血清型,其余52例均为adw2血清型;余17株为C基因型,adrq+血清型。OBI病毒株中C基因型的比例显著高于显性HBV病毒株中C基因型的比例。B基因型显性病毒株发生I104F、L109V、I110L、S113T、T126I、P127T、Q129R、M133L、F134L、P135A、T140A、K141I、T143M/S、V159A、Y161F、A166G和R169P突变,C基因型显性病毒株发生I126S、I126T及F158S突变。OBI病毒株发生Q129R、I126T、 M133T及F161Y突变。结论 浙江省德清县一般人群存在一定比例的OBI感染,OBI感染病毒载量较低,OBI病毒株存在氨基酸突变,C基因型为其可能的优势基因型,需重视OBI预防问题。     

PCR与ELISA检测乙肝病毒的对比及临床意义

目的 探讨荧光PCR法检测HBV-DNA定量ELISA定性检测乙肝病毒标志物临床价值比较.方法 取受试者空腹血清标本同时以荧光定量PCR法检测HBV-DNA和酶联免疫法捡测乙肝病毒两对半.结果 HBV-DNA定量在9.99×10^8 IU/mL～1.00×10^6 IU/mL之间的404例,大三阳比例为85.89％;HBV-DNA定量在9.99×10^5 IU/mL～1.00×10^3 IU/mL之间的416例,小三阳比例为59.38％;HBV-DNA定量在1.00×10^3 IU/ml～1.00×10^2 IU/mL的140例中,HBsAg、HBcAb阳性患者比例为71.43％;HBV-DNA定量＜1.00×102 IU/mL的992例中,HBsAg、HBeAg阴性模式比例为95.67％.结论 荧光定量PCR法检测HBV-DNA和ELISA定性检测HBV表面标记物呈正相关,即HBV-DNA拷贝数多的以大三阳居多,HBV-DNA拷贝数少的以无传染性病毒携带者和阴性者居多.荧光定量PCR可以直接反映体内乙肝病毒感染状态及病毒载量情况,较ELISA更利于判断疾病的严重程度和传染性,更有利于指导临床药物选择和疗效观察.     

昆明地区低病毒载量慢性乙肝患者血清高敏HBV DNA检测分析

  目的  探讨昆明地区持续低水平病毒血症的慢乙肝患者,高敏HBV-DNA载量、HBV的基因型分布特点、HBV P区耐药位点的突变特征,和HBeAg、HBsAg、ALT之间的关系及临床应用价值。  方法   采集2021年1月至2021年12月期间于昆明市第三人民医院就医的707例慢性乙肝患者的血清,分析高敏HBV-DNA、HBV的基因型以及HBV P区的耐药位点突变情况,并分析不同HBV-DNA载量与HBeAg、 HBsAg、ALT之间的关系。  结果  研究707例持续低载量慢性乙肝患者中,高敏HBV DNA（< 500 IU/mL）446例,占（63.50%）,高敏HBV DNA 小于2000 IU/mL的慢乙肝患者共有576例,占（81.90%）;HBeAg 阳性262例（37.05%）;基因分型以C基因型占比最高60.53%（428/707）。在196例HBeAg阳性且HBV DNA < 2000 IU/mL患者组中,男性为主,占69.89%;ALT > 40 U/L占28.57%,有73.47%患者的HBV DNA > 20 IU/mL。在265例HBV DNA < 20 IU/mL的患者中,80.38%（213例）患者HBeAg阴性,19.62%（52例）HBeAg呈阳性。临床指标比较,HBeAg阳性率、ALT异常率、耐药位点和其它位点突变率在HBV DNA 载量水平不相同组之间差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  对持续低水平病毒血症的慢性乙型肝炎患者,选择高敏的PCR技术定期监测乙肝病毒HBV DNA,结合HBeAg、HBsAg 、ALT等临床指标的定量监测,可为后续患者的临床治疗提供客观的参考依据。     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.