亚低温抑制大鼠创伤性神经细胞凋亡的实验研究

目的 研究创伤性脑损伤后神经细胞凋亡机理及其时序空间分布,并探讨亚低温脑保护机理。方法 末端标记法(TUNEL)、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术检测大鼠重度脑损伤后不同脑区神经细胞凋亡的动态变化过程。实验分假手术组、常温脑伤组、亚低温治疗6、12、24h三组。结果 创伤后12h皮层、皮层下、白质、海马等脑区神经细胞凋亡明显增加,其高峰在伤后12～72h,持续可达14d,与对照组相较,相差显著或非常显著。琼脂糖凝胶电泳显示创伤脑组织DNA出现特异凋亡电泳带。流式细胞检测呈现典型亚二倍体核型峰(AP峰)。亚低温治疗明显抑制创伤性神经细胞凋亡。结论 创伤性脑损伤后存在神经细胞凋亡现象。亚低温对创伤性神经细胞凋亡具有明显抑制作用。     

亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马CA3区HSP70表达及细胞凋亡的影响

目的 观察亚低温对大鼠弥漫性脑损伤(DBI)后海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平的表达及细胞凋亡上的影响,探讨亚低温脑保护分子生物机制。方法 将大鼠随机分成空白对照、假手术、单纯DBI和DBI后亚低温治疗四组,按Marmarou氏方法制作大鼠DBI模型,采用免疫组化法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及流式细胞仪(FCM),分别观察各组动物脑海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平的表达及细胞凋亡率。结果 与对照组相比,大鼠DBI后海马CA3区HSP70表达水平及细胞凋亡率均升高(P<0.05);亚低温治疗后,大鼠脑海马CA3区HSP70表达水平较单纯DBI组显著增高(P<0.01),而细胞凋亡率则明显降低(P<0.05)。结论 亚低温对创伤性脑损伤的脑保护机制可能与促进HSP70表达,并减少神经细胞凋亡有关。     

醒脑静注射液对大鼠脑损伤后细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的探讨醒脑静注射液对大鼠创伤性脑损伤(TBI)后细胞凋亡的影响及其机制。方法将大鼠随机分为假手术组、损伤对照组和醒脑静注射液治疗组,后两组再分为伤后6h、12h、24h、48h、72h和168h6个亚组,采用改进的Feeney法制作大鼠TBI模型,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫组化法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达。结果治疗组大鼠脑细胞凋亡率及Bax、Caspase-3表达较损伤对照组显著降低(P<0.05),而Bcl-2表达明显升高(P<0.05)。结论醒脑静注射液对TBI的脑保护作用机制可能与干预伤后凋亡相关基因表达并减少神经细胞凋亡有关。     

亚低温对大鼠短暂全脑缺血后神经元凋亡的影响

目的 探讨亚低温对大鼠脑缺血后神经元凋亡的影响，揭示亚低温的部分神经保护机制。方法 采用“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法来建立大鼠短暂性全脑缺血模型。用神经元尼氏体亚甲兰特殊染色法观察大鼠脑缺血后海马CA1区神经元损害情况；原位细胞凋亡检测法（TUNEL染色）及电镜观察脑缺血后CA1区神经元凋亡情况。结果 与假手术组、低温缺血组相比，常温缺血组海马CA1区神经元缺失明显（P＜0．01）。常温及低温缺血组海马CA1区均存在神经元凋亡，但低温缺血组海马CA1区凋亡神经元数明显少于缺血组（P＜0．01）。结论 经“双侧颈总动脉阻断＋全身低血压”方法建立的大鼠短暂全脑缺血模型证实了亚低温的脑保护作用。全脑缺血后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径，而亚低温可通过抑制缺血性神经元凋亡而发挥一定的神经保护作用。     

大鼠脑创伤后海马CA3区细胞凋亡及相关基因表达研究

目的研究弥漫性脑损伤后不同时间,大鼠海马CA3区细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达情况,探讨脑创伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制.方法应用流式细胞仪和免疫组化法,分别检测脑创伤后不同时间海马CA3区细胞凋亡率及Bcl-2,Bax和Caspase-3基因在蛋白质水平的表达情况.结果脑创伤后海马CA3区存在不同程度细胞凋亡,Bcl-2在脑损伤后表达下降,而Bax和Caspase-3在脑创伤后表达升高;Caspase-3表达的峰值时间(72 h)出现在Bax之后(48 h).结论弥漫性脑损伤后,大鼠海马CA3区存在细胞凋亡及Bcl-2,Bax和Caspase-3的表达变化.Bcl-2/Bax表达比值下降早于Caspase-3的上升,Bcl-2/Bax表达比值改变可能与Caspase-3活化有关,进而启动并加重脑损伤后神经细胞凋亡.     

亚低温对创伤性脑损伤后线粒体α-酮戊二酸脱氢酶活性的影响

目的研究亚低温对脑损伤后病理学，α-酮戊二酸脱氢酶（α—ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDHC）活性以及Caspase-3活性的影响。方法雄性SD大鼠50只随机分七组：假手术组（n=5），液压脑损伤常温组（1．8～2．2atm）（n=25），液压脑损伤亚低温组（n=20）。常温组伤后6h，24h，72h，7d检测创伤侧皮层、海马及丘脑线粒体α—KGDHC活性及Caspase-3的活性。伤后15min应用亚低温，30min内脑温降至33℃并维持4h，检测24h及72h酶活性以及Caspase-3的活性。以及亚低温对损伤后24h皮层丘脑及海马CA3区神经病理的影响。结果Fluoro—jade染色显示亚低温显著减少损伤后24h坏死神经元数目（P〈0．05），伤后24h及72hKGDHC酶的活性显著增加（P〈0．05）。伤后24hCaspase-3的活性显著降低（45％）。结论创伤性脑损伤后早期亚低温能够恢复能量代谢酶的活性，抑制神经元凋亡，减轻损伤后神经元的变性。     

亚低温对凝血酶所致大鼠脑水肿及神经细胞凋亡的影响

目的 探讨亚低温对凝血酶所致大鼠脑组织水肿及神经细胞凋亡的影响。方法 通过立体定位向大鼠颅内(基底节区)注射凝血酶,建立凝血酶所致的脑组织损伤大鼠模型。用干、湿重法测定脑组织水肿程度,用碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪及透射电镜检测细胞凋亡百分率,分别观察了常温凝血酶组、常温对照组、亚低温凝血酶组和亚低温对照组大鼠脑组织水肿和神经细胞凋亡百分率。结果 与常温凝血酶组相比,亚低温凝血酶组大鼠脑组织水肿明显减轻(P<0.05),凋亡细胞百分率也明显降低(P<0.05)。结论 亚低温能减轻凝血酶所致脑组织水肿和减少神经细胞凋亡。     

亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区c-Jun蛋白表达的影响

目的研究亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马CA1区神经元的保护作用,并探讨其可能的机制。方法采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血模型。SD大鼠,随机分为假手术组(SH组)、常温组(IR组)和亚低温组(HIR组)。各组在全脑缺血15min后分别再灌注6h、12h、1d、3d,采用苏木素-伊红(HE)染色观察各时间点海马CA1区细胞形态学变化和TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡,免疫印迹检测c-Jun蛋白表达。结果(1)HE染色结果 IR组和HIR组于全脑缺血再灌注后6h,HE染色未见明显改变,IR组缺血再灌注1d时CA1区出现严重改变,3d时损伤最严重,出现细胞数目减少,细胞胞体缩小、胞核固缩深染,损伤严重,排列紊乱,核膜不清,核仁消失。而HIR组海马存活的锥体细胞数较之IR组12h、1d、3d时间点均明显增加(P<0.05)。(2)TUNEL标记IR组于缺血再灌注后6h在海马CA1区阳性细胞开始增多,缺血再灌注1 d时阳性细胞数最多。而HIR组各时间点阳性细胞数均较IR组明显减少(P<0.01)。(3)免疫印迹结果全脑缺血再灌注后6h c-Jun蛋白在IR组海马CA1区表达开始增加,12h达高峰,持续到3d;HIR组在各时间点的表达均弱于IR组(P<0.01)。结论亚低温通过减少海马CA1区c-Jun的表达,抑制海马CA1区神经元的凋亡,可能是亚低温脑保护作用的机制之一。     

亚低温抑制大鼠弥漫性脑损伤后细胞凋亡的研究

目的：探讨大鼠不同程度弥漫性脑损伤后脑组织的凋亡变化过程及亚低温治疗对脑细胞凋亡的抑制作用。方法：采用大鼠Marmarou颅脑创伤装置制作弥漫性脑损伤模型,然后将128只Wistar大鼠分为未损伤组（对照组）、重度损伤组、轻度损伤组和亚低温治疗组。通过电子显微镜、组织切片原位末端标记DNA片段（TUNEL染色）、琼脂糖凝胶电泳（DNA Ladder法）等方法,观察和比较不同程度脑损伤后,大鼠脑皮层及海马区凋亡细胞的形态、特点和数量。结果：（1）损伤后24-48h,皮层及海马区可见大量细胞皱缩、核碎裂、核不规则等细胞凋亡现象,48h较24h更为严重;亚低温治疗后24-48h,电子显微镜观察皮层及海马区未见细胞皱缩、核碎裂等细胞凋亡现象。（2）TUNEL染色结果显示,随着损伤程度的加重凋亡明显加重,损伤后48h达高峰,然后逐渐下降。轻度损伤组细胞凋亡主要限于海马CA2和CA3区;重度脑损伤组细胞凋亡涉及整个海马结构,同时还广泛累及额顶区皮质。损伤后第24、48、72h,皮层及海马区的凋亡细胞数量较同期未治疗组明显减少。（3）重度损伤后48h,海马和皮层区细胞琼脂糖电泳可见典型的DNA梯状带,其他时间未见梯状带。亚低温治疗组、轻度脑损伤组及未损伤组亦未见梯状带。结论：轻度弥漫性脑损伤后,脑细胞凋亡多发生于海马CA2和CA3区;重度脑损伤后皮层及海马区细胞可发生广泛凋亡。细胞调亡随着损伤程度的加重而加重,高峰位于伤后第2d。亚低温治疗可有效地抑制大鼠弥漫性脑损伤的细胞凋亡。     

亚低温治疗对颅脑创伤后β-淀粉样蛋白表达影响的实验研究

目的 探讨亚低温治疗对大鼠颅脑创伤( TBI)后β-淀粉样蛋白(Aβ)基因和蛋白表达的影响.方法 将60只SD大鼠分为假手术组(n=20)、常温脑创伤组(37C,n=20)和亚低温脑创伤组(32℃,n =20).建立SD大鼠液压打击致颅脑创伤模型.亚低温脑创伤组在液压打击伤后立即接受持续6h的亚低温治疗.伤后24h处死大鼠并取海马组织行HE染色,用RT-PCR、蛋白免疫印迹( Western blot)和免疫组化法检测Aβ基因转录和蛋白的表达.结果 与假手术组比较,颅脑创伤后24hAβ免疫阳性细胞数明显增加(P＜0.01),其mRNA和蛋白表达分别升高1.58和1.76倍.与常温脑创伤组比较,亚低温组Aβ免疫阳性细胞数明显减少(P＜0.01),其mRNA和蛋白表达分别下降68％和64％.结论 亚低温治疗可降低颅脑创伤后Aβ基因转录和蛋白的上调表达,通过抑制Aβ的神经毒性来发挥神经保护作用,而亚低温与Aβ的确切关系还有待进一步研究.     

亚低温对大鼠颅脑外伤后脑组织AQP-4和Caspase-3表达的影响

目的观察亚低温治疗对实验大鼠颅脑外伤后水通道蛋白4(AQP-4)和半胱天冬酶3(caspase-3)的影响,探讨亚低温对颅脑外伤后可能的脑保护分子生物机制。方法健康成年雄性Wistar大鼠45只,采用Feeney法建立脑外伤动物模型,随机分为对照组、创伤组和亚低温组,每组15只,亚低温组在损伤后立即给予亚低温暴露,用干湿重法测定脑组织含水量、免疫组织化学法及图象分析技术检测AQP-4和caspase-3及双重染色免疫组织化学法检测AQP-4和S-100。结果与假手术组比较,大鼠颅脑外伤后脑组织AQP-4和caspase-3的表达及脑组织含水量明显升高(P0.05);亚低温治疗后,大鼠脑组织AQP-4和caspase-3的表达及脑组织含水量较脑创伤组明显降低(P0.05)。结论亚低温对创伤性脑损伤的脑保护机制可能与减轻胶质细胞介导的脑水肿,减少神经细胞凋亡有关。     

一氧化氮合酶对脑损伤后神经细胞凋亡的影响

目的探讨脑损伤后神经型一氧化氮合酶（nNOS）和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）对神经细胞凋亡的影响及其相关机制。方法320只SD大鼠随机分成以下4组：假手术组、脑创伤组、7-硝基吲唑组（nNOS抑制剂）和氨基胍组（iNOS抑制剂），此4组分别划分为伤后3h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d8个时相组，每个时相组均为10只大鼠，采用Marmarou法制造大鼠重型弥漫性颅脑创伤模型，运用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口标记法（TUNEL）和免疫组化法，观察4组不同时相点海马CA1区的神经细胞凋亡情况和Bcl-2、Fas的表达情况。结果①假手术组偶见TUNEL阳性凋亡细胞及Bcl-2、Fas阳性细胞；②脑创伤组，伤后各时相点均出现TUNEL阳性凋亡细胞及Bcl-2阳性细胞，先上升后下降；③7-硝基吲唑（7-NI）组，伤后6h、12h、24h凋亡细胞明显下降而Bcl-2阳性细胞却明显上升（同脑创伤组比较P〈0．05）；④氨基胍（AG）组，伤后2～7d，凋亡细胞及Fas阳性细胞明显下降（同脑创伤组比较P〈0．01）。结论在脑损伤的早期，nNOS能够通过抑制Bcl-2的表达来促进神经细胞的凋亡；在脑损伤的晚期，iNOS能够通过诱导Fas的表达来促进神经细胞的凋亡。     

Neuroglobin expression in rats after traumatic brain injury

In this study,we used a rat model of severe closed traumatic brain injury to explore the relationship between neuroglobin,brain injury and neuronal apoptosis.Real-time PCR showed that neuroglobin mRNA expression rapidly increased in the rat cerebral cortex,and peaked at 30 minutes and 48 hours following traumatic brain injury.Immunohistochemical staining demonstrated that neu-roglobin expression increased and remained high 2 hours to 5 days following injury.The rate of in-crease in the apoptosis-related Bax/Bcl-2 ratio greatly decreased between 30 minutes and 1 hour as well as between 48 and 72 hours post injury.Expression of neuroglobin and the anti-apoptotic factor Bcl-2 greatly increased,while that of the proapoptotic factor decreased,in the cerebral cortex post severe closed traumatic brain injury.It suggests that neuroglobin might protect neurons from apoptosis after traumatic injury by regulating Bax/Bcl-2 pathway.     

亚低温对大鼠局灶性脑缺血后细胞凋亡及Caspase-3的影响

目的 探讨亚低温对脑缺血损伤的保护作用。方法 用原位末端标记（TUNEL）和原位杂交技术分别观察亚低温组、常温组脑缺血不同时间点神经细胞凋亡的变化及Caspase-3的表达。结果 （1）常温组脑缺血后凋亡神经细胞主要分布于缺血周围区,随着时间的延长凋亡细胞数逐渐增加,至12h达高峰,24h后开始下降,7d时仍高于假手术组;（2）亚低温组脑缺血后,凋亡神经细胞也主要位于缺血周围区,数量相对较少,其变化规律与常温组相似,同一时间点相比较,亚低温组均显著低于常温组;（3）常温组脑缺血2h后,神经细胞Caspase-3开始表达,并随着时间的延长而增强,24h达高峰,其后逐渐下降,至7d略高于假手术组;（4）亚低温组脑缺血后,神经细胞Caspase-3的表达也主要位于缺血周围区,其变化规律与常温组相似,同一时间点相比较,亚低温组均显著低于常温组。结论 脑缺血后,缺血周围区神经细胞的凋亡是一个动态的渐进过程,Caspase-3基因在介导脑缺血损伤神经元凋亡过程中起关键作用。亚低温对短暂性脑缺血后的神经元凋亡有明显的抑制作用,亚低温可能通过Caspase-3途径抵抗脑缺血损伤。     

银丹心脑通对脑缺血再灌注大鼠海马区神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的 明确银丹心脑通对脑缺血再灌注时神经细胞凋亡的保护作用,探索其治疗缺血性脑卒中的分子作用机制. 方法 将40只SD雄性大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、阳性对照组(尼莫地平组)、银丹心脑通组.尼莫地平组及银丹心脑通组预先连续灌胃给药7d,假手术组和模型组每日灌服相当量的蒸馏水,第8大制备大鼠大脑中动脉阻塞模型.脑缺血再灌注24 h后应用TUNEL法检测各组大鼠海马CA1区凋亡阳性神经细胞数,应用免疫组化染色测定各组大鼠脑组织中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达. 结果 模型组大鼠均能见到较多的凋亡阳性细胞数及Caspase-3阳性细胞数,与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,银丹心脑通组、尼莫地平组能明显减小凋亡阳性细胞数及Caspase-3阳性细胞数,差异有统计学意义(P＜0.05);银丹心脑通组与尼莫地平组在凋亡阳性神经细胞数及Caspase-3阳性细胞数上比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 银丹心脑通对脑缺血再灌注损伤有一定保护作用,能够减少脑缺血再灌注大鼠神经细胞的凋亡,其作用机制可能与减少脑组织中Caspase-3的表达有关.     

颅脑创伤后亚低温脑保护的蛋白质组研究

目的 本研究应用差异蛋白质组学技术,探讨亚低温和常温条件下,创伤性颅脑损伤大鼠海马组织蛋白质的表达变化.方法 采用侧方液压冲击装置,建立大鼠中度脑损伤模型,亚低温组(n=3)于伤后维持体温(33±0.5)℃持续3h,常温组(n=3)始终维持体温(37±0.5)℃.取大鼠海马组织,通过差异荧光双向凝胶电泳、分离蛋白,获得二维的蛋白质分离图谱,然后通过胶内酶切、抽提酶解肽段、基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析差异的蛋白质点,鉴定出变化的蛋白质.结果 通过DeCyder5.0(GE Healthcare)软件分析报告发现差异1.5倍以上的蛋白点17个(P＜0.05).通过对这些蛋白考染点进行质谱鉴定,鉴定出14个蛋白质,2个为同一种蛋白,实际差异蛋白数为13个.分别是细胞骨架蛋白、介导能量代谢的酶类、参与核酸合成、氧化应激反应的蛋白质、神经突触功能蛋白、细胞内信号传递蛋白及未知蛋白.结论 脑损伤后亚低温及常温条件下,大鼠海马组织蛋白质存在表达差异,鉴定出的差异蛋白质可能与亚低温保护效应的潜在作用机制有关.     

大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后caspase-3、Bcl-2和Bax在脑皮质神经元中的表达。方法将动物随机分为假手术组及缺血组,参照zea longa线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型,各组大鼠分别在左侧MCAO2h再灌注不同时间点断头取脑,脑皮质神经元中caspase-3、Bcl-2和Bax的表达通过免疫组化法来测定。结果缺血组大鼠脑皮质caspase-3的表达较假手术组显著增强(P<0.01),缺血组大鼠脑皮质Bcl-2的表达较假手术组显著增强(P<0.01),缺血组大鼠脑皮质Bax的表达较假手术组显著增强(P<0.01)。结论短暂性脑缺血再灌注上调脑皮质神经元中caspase-3和Bax的表达促细胞凋亡,上调脑皮质神经元中Bcl-2的表达抗细胞凋亡。     

碱性成纤维细胞生长因子对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影晌

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对致痫大鼠的神经保护作用及可能机制。方法给予戊四氮（PTZ）致痫大鼠每日腹腔注射bFGF（bFGF组，n=36）、生理盐水（NS组，n=36），分别于痫性发作后6h、12h、24h、48h、3d、5d处死取脑，切片进行bcl-2、caspase-3染色，用原位末端标记（TUNEL）方法检测海马神经元凋亡细胞。结果痫性发作6h后两组海马CA1、CA3区的bcl-2、caspase-3、TUNEL染色阳性表达差异无统计学意义（P〉0．05）；12～48h表达逐渐增强，bFGF组bcl-2、TUNEL的表达显著高于NS组，bFGF组caspase-3的表达显著低于NS组（P均〈0．01）；3d后表达减弱，bFGF组与NS组的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论bFGF能显著减轻癫痫所致的海马神经元凋亡，提示可能通过调控bcl-2和caspase-3基因的表达发挥作用。