喜树碱对小鼠T淋巴细胞活化、增殖以及细胞周期的影响

目的： 研究喜树碱（CPT）对刀豆蛋白A(ConA)介导的小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖及细胞周期的影响。方法：以ConA刺激小鼠T淋巴细胞，建立小鼠T淋巴细胞活化、增殖的模型，以不同浓度的CPT作用于该模型，流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69分子的表达；以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）染色流式细胞术分析CPT 在Con A刺激下小鼠淋巴细胞的增殖相关指数（PI）；以碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况。 结果： ConA作用6 h后流式细胞术分析显示CD69的表达率为（58.88±0.55）%，不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）CD69的表达率分别为（55.48±0.98）%、（54.67±1.05）%、（50.40±0.82）%、（42.47±1.32）%，均可明显抑制CD69的表达(P<0.01)；ConA刺激48 h后流式细胞术分析显示，不同浓度的 CPT 组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）的增殖指数（PI）明显低于对照组(P<0.05)；细胞周期分析显示刺激48 h后不同浓度的CPT组（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）均出现明显的凋亡峰（apoptosis peak，AP），sub-G1期、G₀/G₁期细胞的比率明显高于ConA刺激组(P<0.01)。结论：CPT可明显抑制ConA刺激的T淋巴细胞的活化、增殖，同时使淋巴细胞阻滞于G₀/G₁期。     

蛋白酶体抑制剂MG132对NK/T淋巴瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的： 探讨蛋白酶体抑制剂MG132（Z-leu-leu-leu-CHO,三肽基乙醛）对NK/T淋巴瘤细胞的增殖和细胞周期分布的影响,研究蛋白酶体抑制剂MG132治疗NK/T细胞淋巴瘤的潜在应用价值。方法: 用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,噻唑蓝［ 3（4,5二甲基噻唑2）2,5二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide,MTT］法检测细胞增殖抑制率,倒置显微镜观察细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡。结果: 1 μmol/L MG132作用24 h,HANK1细胞增殖抑制率为（57.72±7.44）%,而0.1 μmol/L MG132作用24 h,增殖抑制率仅为（3.98±0.07）%;MG132剂量大,增殖抑制率高;1 μmol/L MG132作用24 h后,HANK1细胞G1和G2期细胞分别为（72.33±3.44）%和（12.86±1.29）%,对照组为（63.63±2.29）%和（7.94±1.91）%,用药组G1和G2期细胞明显高于对照组（P<0.01,P<0.05）; 早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞分别为（33.57±2.10）%和（16.66±0.47）%,而对照组仅为（7.18±0.82）%和（3.81±1.06）%,与对照组相比,凋亡率明显增高 (P<0.01,P<0.01)。结论: MG132抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖,使细胞周期G1和G2期阻滞,促进细胞凋亡,并存在剂量和时间依赖关系,蛋白酶体抑制剂MG132很可能成为治疗进展期NK/T细胞淋巴瘤的药物。     

罗格列酮对ADMA氧化应激损伤内皮生长晕细胞的影响

目的：观察过氧化物体增殖剂激活的受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮对非对称性二甲基精氨酸氧化应激损伤内皮生长晕细胞的影响。方法: 分离脐血中单个核细胞，采用贴壁培养法培养扩增内皮生长晕细胞（EOCs）。以10 μmol/L 非对称性二甲基精氨酸（ADMA）和不同浓度的罗格列酮（0、1、5、10 μmol/L）与第2代细胞孵育72 h，检测细胞的凋亡率、增殖能力、成血管能力，RT-PCR法检测内皮一氧化氮合酶（eNOS）mRNA的表达。结果: 采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性。ADMA能抑制细胞功能并增加细胞的凋亡率，1、5 μmol/L罗格列酮能够对抗这种损伤（P<0.01）并能够促进细胞的增殖（P<0.01）。但10 μmol/L罗格列酮的保护作用减弱或丧失，甚至可以抑制细胞的成血管能力(P<0.01)。5 μmol/L罗格列酮浓度组eNOS基因表达增强（P<0.01），10 μmol/L组eNOS基因表达减弱（P<0.01）。结论: 低浓度的罗格列酮（<10 μmol/L）能够减轻和保护由ADMA所致的内皮生长晕细胞的氧化应激损伤，并能够促进内皮生长晕细胞增殖，这种作用部分是通过活化eNOS基因实现的。     

米诺环素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的影响

研究米诺环素(MNC)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,并对其免疫调节作用进行初步探讨。以ConA刺激小鼠淋巴结来源的淋巴细胞,以不同终浓度的MNC与T细胞共培养,荧光抗体染色结合流式细胞术,检测T细胞早期活化抗原CD69的表达;用羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰(CFDA-SE)染色结合流式细胞术,并用ModFit软件分析T细胞增殖相关指数。结果:终浓度为10、25和50μmol/L的MNC显著抑制ConA诱导的T细胞CD69的表达,由ConA组的71.20%±1.08%,分别降低为64.43%±1.39%、53.34%±1.26%和33.65%±1.91%;CFDA-SE染色结果显示,培养48 h和72 h的ConA组T细胞的增殖指数(PI)分别为1.57±0.03和2.06±0.02,各浓度的MNC对ConA刺激的T细胞增殖具有明显的抑制作用,以50μmol/L的MNC抑制作用最明显,48 h和72 h的PI分别为1.01±0.02和1.03±0.01,与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。MNC能有效地抑制小鼠T细胞的体外活化和增殖。具有独立于其抗菌活性的抗炎作用。     

地塞米松介导胸腺细胞凋亡过程中线粒体和细胞结构蛋白的变化

目的：研究地塞米松(DEX)介导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中线粒体质量和结构蛋白变化特点。 方法： 以地塞米松（DEX）诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型，利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术研究细胞凋亡和坏死，JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势（△Ψm）和线粒体质量，利用CFDA-SE染色流式细胞术检测细胞结构蛋白变化。 结果： 在1×10-6mol/L DEX诱导下，小鼠胸腺细胞在6 h凋亡比率为(51.25±5.51)%，对照组为(12.03±2.00)%，差异显著（P<0.01）； DEX组坏死比率为(30.25±3.67)%，对照组为(10.11±1.11)%，差异显著（P<0.01）。DEX组在6h时点的线粒体质量显著低于对照组（P<0.01），FL1平均荧光强度分别为（561.62±54.27）和（900.25±38.80）。DEX同时引起线粒体膜电势的显著下降（P<0.01），对照组FL2平均荧光强度为（267.51±26.48），DEX组为（133.17±12.29）。成熟T细胞培养48 h，CFDA-SE法仅检测到亲代单一细胞峰；而在Con A刺激条件下出现3个子代峰。对照组小鼠胸腺细胞在CFDA-SE染色培养6 h条件下，存在(5.25±1.15)％的低荧光强度细胞群，而在DEX刺激下，该群细胞占（47.39±9.76）％，并且在直方图结果上形成明显的细胞峰。 结论： DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中，线粒体质量和细胞结构蛋白均有所下降；CFDA-SE染色流式细胞术可以作为基于细胞结构蛋白变化的凋亡定量检测方法。     

PPARs激动剂上调内皮细胞表达eNOS并增加NO生成

目的： 观察PPARα激动剂非诺贝特及PPARγ激动剂赛格列酮对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）抑制NO生成的作用。 方法： 体外培养HUVECs，用1×10-7-1×10-4mol/L赛格列酮和10-5、10-4mol/L非诺贝特预处理HUVECs 24 h，再与10-6mol/L AngⅡ 共同孵育12 h，通过RT-PCR和Western blotting分别检测eNOS mRNA和蛋白表达水平；通过Griees反应测定NO2－/NO3－浓度。 结果： 与对照组相比，10-7mol/L AngⅡ刺激HUVEC 12 h下调eNOS mRNA（0.38±0.19 vs 0.13±0.18，P<0.01）和蛋白（35.90±3.18 vs 6.95±2.19，P<0.01）表达，减少NO生成（50.21 μmol/L vs 21.33 μmol/L，P<0.01）。用10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L赛格列酮预处理24 h，上调eNOS mRNA表达（分别为0.36±0.03、0.36±0.14、0.37±0.16、0.43±0.06，与AngⅡ组比较，均P<0.01）和蛋白表达（分别为11.60±3.31、11.78±5.45、13.93±2.46、22.93±3.17，与AngⅡ组相比，均P<0.01），增加细胞培养液NO2-/NO3-浓度。非诺贝特也上调eNOS mRNA和蛋白表达，增加细胞培养液NO2-/NO3-浓度（P<0.01）。 结论： AngⅡ减少eNOS表达，从而减少NO生成。赛格列酮和非诺贝特预处理24 h，可拮抗AngⅡ对HUVECs eNOS mRNA和蛋白表达的抑制作用，增加NO的释放。     

bcl-2基因转染PC12细胞及其神经保护作用的研究

目的　研究基因bcl 2对神经元的生物活性作用。　方法　构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组织化学检测外源基因表达 ;10 μmol L、5 0 μmol L和10 0 μmol L顺铂处理转染重组质粒的实验A组细胞 ,同样条件处理转染空质粒的对照B组细胞 ,72h后比较两者存活的细胞数 ;流式细胞仪检测分析两者的细胞周期指数。　结果　成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,并用脂质体介导的方法获得了稳定表达Bcl 2的细胞克隆 ;10 μmol L、5 0 μmol L和 10 0 μmol L顺铂处理后 ,实验A组存活的细胞数分别为 2 76± 13、185± 11和 10 8± 10 ,而对照B组中存活的细胞数分别为 10 0± 9、12± 3和 2± 2 ,两者相比有显著性差异 ;流式细胞仪检测显示 ,实验A组S期细胞所占百分比为 8 81% ,比对照B组 2 5 79%明显减少。　结论　bcl 2能够拮抗顺铂对神经元的损害作用 ,促进神经细胞存活 ,其神经保护作用机制可能通过调控细胞周期来完成     

靶向MDR1基因的RNAi稳定逆转结肠癌细胞的多药耐药性

目的： 探讨靶向多药耐药蛋白-1 (MDR1)基因的RNA干扰（RNAi）对结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性的稳定逆转作用。方法：分别构建含编码#4029 MDR1 siRNA和#4123 MDR1 siRNA的质粒载体,并转染COLO 320DM结肠癌多药耐药细胞,采用G418筛选克隆细胞,经实时定量RT-PCR及Western blotting鉴定阳性克隆细胞。MTT法检测细胞活力并计算各抗肿瘤药的IC50。流式细胞术检测细胞周期并计算PI/AI值。流式细胞仪测定细胞内adriamycin药物累积浓度。结果：阳性克隆细胞（clone #4029和clone #4123）的MDR1 mRNA和P-gp的表达均被抑制。COLO 320DM结肠癌亲本细胞adriamycin及vincristine的IC50分别为9.616 μmol/L和0.358 μmol/L,而clone #4029的IC50分别降至1.094 μmol/L和0.023 μmol/L（P<0.01）,clone #4123的IC50分别降至0.780 μmol/L和0.035 μmol/L（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用adriamycin及vincristine处理后其PI/AI值分别为5.68及9.59,而clone #4029的PI/AI值分别降至2.74及3.59（P<0.01）,clone #4123的PI/AI值分别降至2.75及3.24（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用10 μmol/L adriamycin处理后细胞内adriamycin累积浓度为27.92,而clone #4029及clone #4123细胞内adriamycin累积浓度分别增加至187.24和215.57（P<0.01）。结论：稳定转染含编码MDR1 siRNA的质粒载体能稳定逆转结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制NF-κB活化对HL-60细胞的化疗增敏作用

目的：探讨化疗诱导性核因子κB的活化机制及抗氧化抑制NF-κB活化对白血病细胞凋亡及化疗敏感性的影响。 方法： 采用间接免疫荧光方法和凝胶迁移率变动试验（EMSA）观察不同浓度的化疗药物单独或与抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）联合作用于HL-60细胞后NF-κB的活化反应；运用流式细胞术和MTT试验比较NF-κB活化及活化抑制对HL-60细胞凋亡及化疗敏感性的影响。 结果： EMSA试验表明，柔红霉素（DNR）和足叶乙甙（VP-16）均呈剂量依赖性诱导NF-κB活化；RelA亚基位于细胞核进一步证实了NF-κB活化。PDTC呈剂量依赖性抑制诱导性NF-κB活化，当其浓度达到100 μmol/L时，NF-κB活化被完全抑制。比较PDTC干预前后细胞的凋亡反应，发现2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L VP-16诱导的细胞凋亡指数分别由(5.34±0.62)%、(10.16±0.42)%、(17.32±1.15)%增至(8.97±0.81)%、(16.01±1.06)%、(22.96±1.33%)，且PDTC显著增强DNR及VP-16对HL-60细胞的生长抑制率(P<0.01)。 结论： 反应性氧中间产物介导化疗诱导性NF-κB活化，抗氧化抑制NF-κB活化可以增进HL-60细胞凋亡及化疗敏感性。     

芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的抑制作用

研究芹菜素(apigenin,AP)对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,探讨其作用机制,以及将其开发为免疫抑制药物的可能。无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L)的芹菜素预孵育4 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导T细胞活化和增殖,并用MTT法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。荧光标记抗体双染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞表达早期、中期和晚期活化抗原CD69、CD25和CD71的影响;以二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceindiacetate-succinim-idyl ester,CFDA-SE)染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的影响,并应用ModFit软件分析其增殖指数(proliferation index,PI)。结果显示,25~200μmol/L AP对ConA诱导的T细胞CD69、CD25的表达有显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量依赖关系;25μmol/L和50μmol/L的AP抑制CD71的表达,但高浓度(大于100μmol/L)才有显著抑制作用(P<0.01)。各浓度AP对ConA诱导的T细胞增殖均有显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量依赖关系。表明在一定浓度范围内,AP可显著抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外活化及增殖,有望通过进一步研究将其开发成免疫抑制药物。     

红景天苷对小鼠原代T淋巴细胞体外行为的影响

目的:分析红景天苷(Sal)对小鼠原代T淋巴细胞体外行为的影响。方法:无菌分离并培养BALB/c近交系小鼠淋巴结细胞,MTT比色法检测并分析Sal对小鼠T淋巴细胞活力的影响;荧光染料标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术(FCM)检测刀豆蛋白A(Con A)诱导作用下Sal对T淋巴细胞活化抗原CD69表达水平的影响。羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色分析T淋巴细胞体外增殖情况。2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光染色检测小鼠T淋巴细胞胞内活性氧簇(ROS)生成。Di OC6(3)染色检测Sal对T淋巴细胞胞内线粒体活性的影响以及地塞米松(DEX)诱导作用下Sal对T淋巴细胞线粒体膜电位的影响。制备小鼠胸腺T淋巴细胞悬液,FCM检测DEX诱导作用下胸腺T淋巴细胞的凋亡率。结果:终浓度为80、160和320μmol/L的Sal均能提高T淋巴细胞活化抗原CD69的表达水平(P0.05)。Sal能促进Con A诱导72 h条件下T淋巴细胞体外增殖(P0.01),且能减少T淋巴细胞胞内ROS生成量(P0.05),对T淋巴细胞线粒体膜电位有保护作用(P0.01)。Sal能明显降低DEX诱导条件下的胸腺T淋巴细胞凋亡率(P0.01)。结论:Sal能够促进T淋巴细胞的体外活化和增殖,减少T淋巴细胞内ROS的产生,维持细胞内线粒体膜电位稳定性,抑制DEX诱导条件下胸腺T淋巴细胞的凋亡。     

桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69 T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69 T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69 T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。     

槲皮素对小鼠T细胞体外活化的抑制作用

目的:通过分析槲皮素对淋巴细胞早期活化标记物CD69表达的影响,探讨其对T淋巴细胞体外活化抑制作用的机制。方法:分离小鼠淋巴结细胞,加入多克隆刺激剂及槲皮素共同培养,分别于2、6、24h收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞仪对T细胞的CD69分子表达情况进行分析并计算抑制率。结果:槲皮素(终浓度10μmol/L)对未受刺激的T细胞CD69表达百分率无明显影响,而经佛波醇酯(PDB)及刀豆蛋白A(ConA)活化同时加入槲皮素的T细胞CD69表达百分率在2h、6h及24h均显著下降(P＜0.01)。槲皮素对PDB的抑制率随作用时间延长而明显下降,对ConA的抑制率平缓而持久。结论:槲皮素对PDB、ConA活化的T淋巴细胞均显示明显的抑制效应,表明该药可能作用于T细胞活化信号传递通路蛋白激酶Cθ或其下游部位,并且,这种抑制效应表现出一定的可逆性。     

放线菌酮对小鼠T细胞活化影响的血清免疫药理评价

目的:利用淋巴细胞的早期活化标记物CD69的表达,探讨CHX对T淋巴细胞体外活化的影响。方法:分离小鼠淋巴结细胞,分别与放线菌酮(CHX)、CHX血清预孵1h,加入多克隆刺激剂继续培养,总计培养24h后收获细胞,进行双色免疫荧光标记,以流式细胞术对T细胞的CD69分子表达情况进行分析。结果:在CHX(终浓度10μmol/L)、CHX血清作用下,ConA活化的T细胞CD69表达百分率依次为(12.33±4.75)%、(20.39±6.32)%,与相应对照[分别为(64.67±3.00)%、(64.35±10.13)%]比较均有显著差异(P＜0.01);相应的,药物作用下PDB活化的T细胞CD69表达的百分率依次为(13.07±11.05)%、(6.10±4.91)%,与相应对照[分别为(84.79±6.87)%、(79.68±4.17)%]比较均有显著差异(P＜0.01)。结论:CHX(10μmol/L)、5%的CHX血清对ConA、PDB活化的T淋巴细胞均显示了强烈的抑制效应,证明T细胞活化过程中CD69的表达存在蛋白质的从头合成,对"CD69表达中CD69分子可能储存于细胞浆及其表达的发生并不需要蛋白质的从头合成"这一观点提出质疑。     

环孢素A治疗再障和骨髓增生异常综合征T淋巴细胞异常激活的变化

研究再生障碍性贫血(AA)用环孢素A(CsA)治疗前后和骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞培养前后早期激活标志CD69的表达及其意义。将外周血在PHA20μg/ml条件下进行全血细胞培养,于0h和4h分别用双色免疫荧光标记流式细胞仪对CD4+、CD8+T淋巴细胞CD69的表达进行分析。发现PHA刺激前初治SAA和MDS-RA+MDS-RAS患者CD4+、CD8+细胞CD69的表达率增高,CAA与RAEB+RAEB-T患者CD8+细胞CD69的表达率增高;PHA刺激后AA与MDS患者CD4+、CD8+细胞表达CD69明显增强,AA患者CD4+细胞CD69的表达率高于CD8+细胞。CsA治疗后SAA患者PHA刺激前CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低,CAA患者CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。治疗后AA患者PHA刺激后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。CsA治疗有效的AA患者治疗前PHA刺激前后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率明显增高,治疗后明显减低。初治AA患者PHA刺激前后CD4+细胞CD69的表达率均明显高于MDS患者。说明T细胞早期活化及其活化潜能增强,以及产生针对自身造血干/祖细胞的细胞毒效应在AA和MDS发病中起重要作用,CsA能抑制AA患者T细胞的早期激活。     

蛋白激酶Cθ信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人γδT细胞增殖和分化中的作用

目的 研究蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)信号途径在结核分枝杆菌抗原(Mycobacterium tuberculosis antigen,Mtb-Ag)激活人γδT细胞增殖和分化中的作用.方法 健康人外周血单个核细胞(PBMC)用Mtb-Ag和IL-2优势刺激和扩增γδT细胞,或预先用5.0μmol/L Rottlerin(楸毒素)预处理,培养不同时间后,用流式细胞术(FCM)检测γδT细胞表面活化分子和细胞因子表达;同时采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记细胞,流式细胞术分析Mtb-Ag刺激γδT细胞后的增殖和各子代细胞百分率.结果 PBMC经Mtb-Ag刺激后3d,γδT细胞CD69和CD25表达分别为46.2%和45.6%,而Rotderin预处理显著地抑制了CD69和CD25表达(P＜0.01);PBMC经Mtb-Ag激活培养5、10和15d,培养扩增细胞中的γδT细胞比例分别为9.6%、54.6%和82.4%,其中第5天已有少部分γδT细胞发生增殖,第10天和第15天时几乎全部γδT细胞分裂都在6代以上,用Rottlerin预处理,显著抑制了γδT细胞增殖反应,但在培养第10天后仍有少部分γδT细胞发生增殖反应;同时在培养第7天、14天和21天,用PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)再刺激后,产生IFN-γ的γδT细胞均在80%左右;培养21d时,有2.6%的γδT细胞表达IL-4.在Rottlerin预处理组产生TH1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞均显著减少(P＜0.05),而γδT细胞表达TH2型细胞因子IL-4则几乎完全抑制(P＜0.01).结论 PKCθ信号途径在Mtb-Ag刺激γδT细胞的增殖和分化中均起重要作用.     

同种异基因移植引流淋巴结及外周血T细胞活化分析

目的:研究同种异基因移植早期局部引流淋巴结和外周血T细胞的活化情况。方法:以小鼠前臂皮下非血管化心肌移植为模型,利用流式细胞术分析前臂引流淋巴结及外周血不同T细胞亚群的CD69表达水平。结果:同种异基因移植后72h,引流淋巴结CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均明显高于移植前(P＜0.01),且CD8⁺T细胞的表达水平高于CD4⁺T细胞(P＜0.01);各组外周血CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达百分率均无显著差异;局部应用弗氏完全佐剂和全身应用CsA可分别增强和抑制同种异基因移植后CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的CD69表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:局部引流淋巴结T细胞CD69的表达水平可及时反映受者T细胞对同种异基因抗原的识别情况。