用T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38相结合的蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38MAPK结合的蛋白。方法 以p38MAPK为靶蛋白，分别用不同的介(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果 选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆，经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断，回收PCR产物并进行测序，将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列，得到了46个编码蛋白的序列。结论 T7噬菌体展示筛选系统筛选新的结合蛋白简单、快速、有效。     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.     

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白。方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1（CytochromecOxidaseSubunitI,COX1）。结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreS1的致病机制提供重要依据。     

应用T7噬菌体展示技术筛选与sLRIG1亲和结合蛋白

目的 用T7噬菌体展示技术（phage-displayed technique, PDT）筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1, sLRIG1）相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制找到突破点。方法 利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统（baculovirus expression system, BEVS）获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序。结果 经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1.85×10⁶PFU,趋于稳定。回收的DNA片段多在250~750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,最终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关。结论 通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选中药的药物靶点蛋白研究进展

噬菌体展示技术是一种有效的药物靶点筛选工具,可用其筛选中药的药物靶点蛋白。其原理是将外源性蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达。药物靶点是药物在体内的作用结合位点,是药物筛选和新药研究的基础,良好的药物靶点也是发现性质优良药物的基础。利用现代生物技术为基础的高通量药物筛选技术,进行中药活性组分筛选是实现中药现代化的有效途径,并促进我国天然药物的开发和应用,为中药的研究提供一套完整的筛选和验证方案。      

噬菌体展示肽库技术应用的研究进展

噬菌体展示肽库技术是一种新的肿瘤筛选技术，它将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，使高通量筛选多肽配体变得容易些。该技术在研究蛋白质之间的相互作用、寻找肿瘤特异性抗原和治疗性靶肽以及在新型诊断试剂和疫苗研制中都有重要用途。     

噬菌体展示技术及其在药物筛选中的应用

噬菌体展示文库是目前广泛应用于生物医学领域的较为重要的分子工具,近年来相关研究进展迅速,目前该技术以具有库容量大、结合特异性强等特点而成为药物筛选的实用性工具.本文以噬菌体展示技术的原理为出发点,对噬菌体载体的分子生物学、噬菌体展示文库的构建和筛选及其在药物筛选中的应用进行了综述.     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF-7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

利用T7噬菌体展示技术构建人舌鳞癌细胞多肽文库

目的:本研究拟构建人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为进一步筛选和鉴定与舌鳞癌相关的蛋白或多肽打下基础。方法:人舌癌细胞株Tca8113,QiaGen法提取细胞mRNA,逆转录合成双链cDNA后与T7Select10-3载体连接,体外包装并扩增得到T7噬菌体展示多肽文库。结果:构建了人舌鳞癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,原始文库重组滴度为鳞癌1.7×106pfu,扩增后滴度为3×1010pfu/mL。随机从文库中抽取10个克隆PCR扩增插入片断,电泳结果显示构建的文库中均有插入片段,文库插入率高达100%。所构建的文库插入片断大小在（0.4～1.0）kbp之间。结论:成功构建了人舌癌细胞株Tca8113的T7噬菌体展示多肽文库,为下一步筛选和鉴定与舌癌相关的蛋白或多肽奠定了基础。     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

基于T7RNA聚合酶／启动子的细胞融合报导系统载体的构建

目的：建立T7RNA聚合酶／T7启动子载体系统,作为观察细胞融合是否成功的报导系统。方法：设计并合成引物从BL21细菌中扩增T7RNA聚合酶序列,并将其克隆进入真核表达载体pRc／CMV2中,作为RNA聚合酶的供体。T7RNA聚合酶特异性识别的r17启动子人工合成,构建于荧光素酶的表达载体pGL3中,利用其荧光素酶基因作为报导基因。两质粒共转染A549细胞和VeroE6细胞,检测荧光素酶的表达。结果：共转染pRc／CMV2。T7RNAP和pGL3-T7的A549细胞和VeroE6细胞的荧光强度分别为57745±7747和43679±8616,转染质粒pGL3-T7的细胞空白对照荧光强度1034±201和1091±157,分别与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：成功构建了T7RNA聚合酶/T7启动子载体的细胞融合报导系统,可应用于细胞融合的相关实验研究中。     

抗hTNF-α中和抗体识别表位的筛选和鉴定

目的:对噬菌体随机线性7肽库进行筛选,得到能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合的表位肽.方法:以抗hT-NF-α中和抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA,竞争抑制ELISA及MAP点杂交鉴定阳性噬菌体克隆.结果:经3轮筛选后随机挑取50个噬菌体克隆,经ELISA检测其中15个克隆显示与抗hTNF-α抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为:WTFKMQP,WPFKMSP,WPYK-MIP和WNYKMLP,竞争性ELISA结果显示四个序列均能与TNF竞争性结合抗hTNF-α mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽是能与抗hTNF-α抗体特异性结合的多肽.结论:筛选得到的7肽序列具有很高的同源性,并能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合,为hTNF-α相关多肽疫苗的研究提供依据.     

人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

目的 构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病 人转移淋巴结,提取淋巴结总ＲＮＡ,逆转录ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和Ｋ轻链ｃＤＮＡ。依次将ＰＣＲ产物插入载体pＣomb３的 相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体Ｆab基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选 ２种Ig亚类的重链 Ｆd片段、２种κ轻链cＤＮＡ得到扩增。 Ｆd片段和κ轻链均插入pＣomb３的重组率为４０％,Ｆab噬菌 体表达库容达１．４８×１０６。经３轮淘选,抗体库得到约１２０倍的富集。３轮抗体库的点印记免疫染色均显示有Ｆab表达;酶 联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈 现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。     

HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的预测与鉴定

目的:初步鉴定人乳头瘤病毒18型E7抗原的HLA-DRB1*0301限制性辅助T淋巴细胞(T-HelperCell)表位。方法:用SYFPEITHI软件预测HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位,候选表位分别命名为P1、P2、P3,以固相多肽合成技术合成,并运用HPLC进行纯化和质谱法(MS)鉴定。以密度梯度法分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC),合成肽刺激PBMC,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测淋巴细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞表型。结果:多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激PBMC后能够有效诱导CD4 T淋巴细胞增殖。结论:P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th细胞表位。     

免疫共沉淀联合质谱分析筛选克罗恩病中Intelectin-1相互作用蛋白的初步研究

目的 对比克罗恩病患者的病变与正常肠黏膜,筛选与肠凝集素-1(Intelectin-1)相互作用的差异蛋白,探讨Intelectin-1及其相互作用蛋白在克罗恩病发展中的作用.方法 利用免疫共沉淀技术筛选克罗恩病患者病变及正常组织中与Intelectin-1相互作用的蛋白;利用MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析技术鉴定与Intelectin-1相互作用蛋白;并使用免疫共沉淀和Western blot分析技术验证所鉴定的Intelectin-1相互作用蛋白.结果 利用免疫共沉淀联合质谱分析技术成功筛选出4个与Intelectin-1相互作用差异蛋白,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)、腺苷酸三磷酸酶(ATPase)、热休克蛋白90(HSP90)、锌指蛋白(ZNF).结论 Intelectin-1可能通过与TRAF3、ATPase、HSP90、ZNF蛋白相互作用,而影响克罗恩病的发展.     

人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。