肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力蛋白NleB1的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定

目的：构建肠出血性大肠杆菌（ EHEC） O157∶H7毒力蛋白nleB1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备NleB1的抗血清。方法从EHEC O157∶H7 EDL933株的全基因组中PCR扩增出编码nleB1的990个碱基序列,构建原核表达载体pET24a-nleB1,将构建的重组表达载体的质粒pET24a-nleB1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白His-NleB1表达,并利用镍柱进行亲和层析纯化和切胶纯化,以纯化后的融合蛋白His-NleB1为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清。 Western印迹和ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建了pET24a-nleB1原核表达载体,纯化得到融合蛋白His-NleB1,进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western印迹和ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了EHEC O157∶H7的毒力蛋白NleB1的多克隆抗体,为研究EHEC O157∶H7毒力蛋白NleB1的功能奠定了基础。     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。     

人CD20胞外区与噬菌体pⅢ融合基因在E．coil中的可溶性表达

目的：克隆人CD20胞外区基因(cdw)和丝状噬茵体(M13KD7)G3蛋白N端结构域(pⅢN1)基因，并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法：利用逆转录PCR和PCR方法分别克隆CD20胞外区基因和pⅢN1基因，然后将二者融合克隆入pTIG-Trx表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达。结果：可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的约25％，表达产物可被抗CD20分子的单克隆抗体识别。结论：成功地表达并鉴定了人CD20胞外区蛋白，为利用噬菌体抗体库进行抗CD20抗体的筛选奠定了基础。     

CT抗原NY-ESO-1基因克隆、表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达人CT抗原NY-ESO-1,对表达产物进行Western印迹鉴定和纯化,为今后利用其进行肿瘤疫苗的研究奠定基础.方法:通过全基因拼接获得NY-ESO-1基因,构建重组表达载体NY-ESO-1-pET28a( ),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导获得表达,利用单克隆抗体进行Western印迹鉴定,通过Ni柱亲和纯化获得纯化蛋白.结果与结论:拼接的NY-ESO-1全基因经测序证明与GenBank中人的NY-ESO-l全基因完全相符;构建的原核表达载体NY-ESO-1-pET28a( )可稳定地可溶性表达NY-ESO-1蛋白;经Ni柱亲和纯化获得较好的纯化结果;利用鼠抗人单克隆抗体对表达的蛋白进行验证,结果显示阳性.本研究成功利用原核表达系统实现了对CT抗原NY-ESO-1的可溶性表达.     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a( )表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a( )载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a( )并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选甲型H1N1流感病毒抗原模拟表位的研究

目的筛选特异性甲型H1N1流感病毒抗原模拟表位。方法应用噬菌体表面展示技术,以2009年甲型H1N1流感康复患者的血清作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机环七肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增筛选。从顶部琼脂噬菌斑中随机挑取32个克隆至处于对数生长期的大肠埃希菌中培养,采用ELISA,交叉反应以及竞争抑制性实验筛选并鉴定阳性克隆,对阳性克隆进行DNA序列分析,对其编码的展示于噬菌体表面的氨基酸序列与流感病毒血凝素(HA)基因进行同源性比较,确定甲型H1N1流感病毒抗原的模拟表位。结果从随机挑选的32个克隆中得到12个阳性克隆,确定氨基酸序列PLHARLP为甲型H1N1流感病毒抗原的模拟表位,其表位由HA的第52,53,59,60,61,83,271位氨基酸共同构成。结论用噬菌体环七肽库筛选得到甲型H1N1流感病毒的模拟表位,为开展用流感病毒模拟表位探索新的流感防治方法奠定了基础。     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定

目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,在变性条件下纯化包涵体,经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体,表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体,经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白,为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。     

半乳糖凝集素-1的表达纯化与生物活性分析

目的：获得重组人半乳糖凝集素-1（galectin-1）蛋白,并分析其生物学活性。方法：PCR方法扩增目的基因,将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）,获得重组质粒pET-galectin;将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导,获得目的蛋白的表达;采用Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,用红细胞凝集试验分析其生物学活性。结果与结论：成功构建重组原核表达质粒pET-galectin,目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化后,得到的蛋白纯度可达80%以上。红细胞凝集试验结果表明获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,可进一步用于半乳糖凝集素-1功能研究。     

利用免疫蛋白质组学鉴定炭疽杆菌蛋白MetK及其免疫原性验证

目的验证免疫蛋白质组中鉴定到的S-腺苷甲硫氨酸MetK蛋白的免疫原性。方法免疫蛋白质组学的方法鉴定到MetK蛋白,通过PCR方法扩增metK基因全长,然后将其克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌DH5α,测序正确后提取质粒转入BL21（DE3）中进行诱导表达。再通过Ni-NTA柱纯化MetK蛋白,纯化后的蛋白免疫SPF级的BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,通过多克隆抗体与炭疽芽孢杆菌A16R全菌蛋白Western印迹检测,验证MetK蛋白的免疫原性。结果与结论成功表达了MetK蛋白,制备了其多克隆抗体,为免疫蛋白质组学鉴定到的蛋白点进行验证,也为研究MetK蛋白的生物学功能研究提供了条件。     

长双歧杆菌NCC2705中胆盐水解酶基因的克隆表达及其特性的研究

目的克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对茵体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性。方法采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21（DE3）和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap—bsh／NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验。结果在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS—PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bsh的菌株pMgap—bsh／NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率。结论所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高茵体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大。     

沙门菌属pad蛋白的原核表达及抗原性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达沙门菌属pad蛋白,纯化后制备兔抗pad抗体。方法利用PCR方法从肠炎沙门茵中扩增出pad基因,构建pET一32a（＋）一pad重组表达质粒;将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性克隆,测序鉴定后,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间以诱导重组蛋白的表达;以纯化的pad蛋白免疫家兔,制备抗pad多克隆抗体并进行鉴定。结果与结论成功扩增得到pad基因,经双酶切和测序证实重组表达质粒构建成功,经过诱导条件的优化,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为41×10。的目的蛋白;纯化的重组蛋白免疫家兔后,能够有效地刺激家兔产生特异性抗体,经琼脂糖双向扩散测定抗血清效价达到1：32以上。为进一步研制沙门茵属体外快速检测试剂打下了基础。