小肠结肠炎耶尔森菌环介导管温扩增技术检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测。方法针对小肠结肠炎耶尔森氏菌毒素基因yruI/yru R设计5条特异性引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为74fg和43cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为76cfu/g。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1.5h即可完成,有望发展成为快速检测小肠结肠炎耶尔森菌的有效手段。     

复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101~1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。     

鼠疫耶尔森氏菌三色荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种三色荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法根据鼠疫耶尔森氏菌pPCP1质粒上的pla基因、编码F1抗原在pMT1质粒上的ca f1基因以及菌体染色体上的3a基因序列,设计特异性的引物和不同荧光标记的Taqman荧光探针,优化反应体系和扩增条件,考察该方法检测的敏感度、特异性、重复性和稳定性,最终建立三色荧光定量PCR检测方法。结果本研究所建立的方法对鼠疫耶尔森氏菌DNA的扩增效率高,最低检出限为1×102copies/ml,特异性高,重复性的变异系数在合理范围内,稳定性好。结论建立了一种同时检测鼠疫耶尔森氏菌pla、ca f1和3a基因的三色荧光定量PCR方法,该方法敏感度和特异性高,能够实现快速检测的目的。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立

建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的六个区域设计四条LAMP引物，65℃保温约60min，完成对沙门菌属的扩增，扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证LAMP方法的特异性；将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌没有出现LAMP扩增，LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实；LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu／ml，PCR检测下限为100cfu／ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。     

志贺菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 建立志贺菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)特征性保守序列设计1套4条引物,应用LAMP技术对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性;使用LAMP和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度;使用重组质粒计算其初始拷贝数与反应时间之间的线性关系以评估定量检测的可能性.结果 荧光定量LAMP扩增曲线图显示,LAMP技术可以在1 h内获得结果;有较好的特异性,与其他17种食源性致病菌无交叉反应;LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上,检测限达到200拷贝/μL;平均变异系数＜5%;反应时间与模板初始浓度有良好的线性关系(R2=0.985 5).结论 志贺菌环介导等温扩增检测体系是一种快速、灵敏、特异的核酸筛查方法,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

环介导恒温扩增检测小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立1种基于环介导恒温扩增(LAMP)的快速、敏感、特异检测小肠结肠炎耶尔森氏菌方法,为诊断该菌感染及食品中污染检测提供实验室诊断依据。方法根据GenBank中foxA序列,设计多套引物,筛选最佳引物、优化反应条件,建立小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA的LAMP检测方法,加入荧光染料钙黄绿素以肉眼判断结果。结果根据扩增曲线,从4组引物中筛选出最优引物组进行LAMP检测,63℃恒温15min开始出现扩增,最低检测限为1.46×10~(-7)g/L,高于普通PCR最低检测限1个数量级;以金黄色葡萄球菌、沙门菌、假结核耶尔森氏菌等10株病原菌为模板进行LAMP检测,均未检出非特异性扩增反应。测序结果分析显示,LAMP扩增区不同菌株序列一致性约为95%,具有很好的保守性。结论建立的方法能够满足基层实验室、应急检测等使用需求,有良好的应用价值,可在有条件的基层进行推广。     

LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较

[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较。[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高。应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致。[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段。     

用Taq Man探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的　建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法　针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针,进行实时定量聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)分析,优化反应体系,检测其灵敏度、特异性和重复性。结果　以EV76灭活培养物为对象,检测灵敏度可达每反应体系0 .0 8CfU ;30株非鼠疫菌株的检测结果表明,对照菌株均为阴性,检测特异性良好;对同一样品进行17次重复检测,其循环阈值的标准偏差为0 .35。结论　TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测,为鼠疫监控、诊断提供有力手段     

半套式聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌

目的 建立一套食物中的单核细胞增生性李斯特氏菌、耶尔森氏菌和融溶血性弧菌等肠道致病菌的快速检测方法。方法 采用裂解法提取DNA与各自的三条引物进行二次聚合酶链反应扩增（简称半套式PCR），检测模糊阳性牛奶中部分肠道致病菌。结果 常规PCR能检出100个活菌的存在，在其产物进行半套式PCR检测时有10个活菌存在时即可扩增出特异性产物，提高10倍。最低检测限可达10cfu（集落形成单位）。结论 本方法具有特异性强、敏感性高、简便快速等特点。     

用TaqMan探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针，进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析，优化反应体系，检测其灵敏度、特异性和重复性。结果以EV76灭活培养物为对象，检测灵敏度可达每反应体系0．08CfU；30株非鼠疫菌株的检测结果表明，对照菌株均为阴性，检测特异性良好；对同一样品进行17次重复检测，其循环阈值的标准偏差为0．35。结论TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测，为鼠疫监控、诊断提供有力手段。     

鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测

目的 建立一种快速检测鼠疫耶尔森菌的方法.方法 以编码F1抗原的基因caf1为靶序列,人工合成基因序列,制备重组质粒作为鼠疫耶尔森菌检测的标准样品;用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因设计引物和TaqMan荧光探针,进行实时FQ-PCR检验,评价该方法的准确性、敏感性及特异性.建立鼠疫耶尔森菌TaqMan探针实时FQ-PCR检测方法.结果 本研究成功构建了质粒pUC57-caf1,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.03×102～5.03×107拷贝数之间,具有较好的线性关系,相关系数1.0.实时FQ-PCR检验最低可检测出5.03×102拷贝数的重组质粒,灵敏度比普通PCR高100倍.特异性检测试验可选择性检测出鼠疫耶尔森菌,与其他细菌无交叉反应,结果与普通PCR一致.对同一浓度的重组质粒进行15个平行样品的重复性试验,Ct值标准差为0.28.结论 建立TaqMan探针实时FQ-PCR检测技术,能够快速、准确、特异的检测鼠疫耶尔森菌,为鼠疫监控、诊断提供技术支持.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

鼠疫菌免疫胶体金快速检测方法的建立

目的利用免疫胶体金技术建立一种简便、快速并适用于基层人员使用的鼠疫菌抗原检测方法。方法将抗鼠疫菌F1抗原的抗体致敏硝酸纤维素膜,用于捕获鼠疫抗原,然后用免疫胶体金颗粒进行标记。结果应用鼠疫菌免疫胶体金快速检测法最低可检出不同鼠疫菌(EV和Evp株)1.56×105CFU/ml,检测鼠疫菌F1抗原最低可检出1ng/ml,与鼠疫反向间接血凝法的检测结果一致;并且不与假结核小肠结肠炎等耶尔森菌以及其他相关细菌发生交叉反应。结论鼠疫菌免疫胶体金快速检测法具有较好的特异性、敏感性和简便快速的特点。     

应用Taq Man荧光定量聚合酶链反应技术检测鼠疫耶尔森菌

目的发展一种快速、敏感、特异的检测鼠疫耶尔森菌方法。方法应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术，针对pMT1质粒上的caf1基因，pPCP1质粒上的pla基因，染色体上的与色素沉着相关的hms基因和侵袭素inv基因设计TaqMan引物探针，进行荧光定量PCR检验，评价方法的特异性、敏感性；构造并应用上述引物探针的外标对照定量；构造pla的内标对照，采用多重荧光定量PCR（FAM，VIC荧光检测），发现假阴性；采用UDG抗污染、ROX参照荧光染料矫正背景噪音，提高检验能力；检验模拟鼠疫耶尔森菌强毒株和EV菌感染的动物脾脏器样本，评价该法在实际工作的应用。结果设计的引物、探针特异性良好，pla、f1、hms指标的敏感性分别是最低检出10拷贝、1拷贝、1拷贝。结论该方法能快速、灵敏、特异检出鼠疫耶尔森菌，对鼠疫监测、预防生物恐怖等方面具有重要意义。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用

目的建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性。该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25cfu/mL,可在60min内完成扩增反应。用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5%,与传统方法一致。结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性。