重组人干扰素-β1b对恒河猴免疫原性的影响

目的:研究重组人干扰素-β1b(rhIFN-β1b)对恒河猴的免疫原性及其对疗效的潜在影响.方法:实验分溶剂对照组及rhIFN-β1b低、中、高剂量组,分别皮下注射1.25%人血清白蛋白0.36mL·kg-1及rhIFN-β1b 4.0×106,1.2×107及3.6×107IU·kg-1,连续90d.血清结合抗体测定采用ELISA法,中和抗体测定采用细胞病变抑制法.结果:给药3周后,3个给药组动物均出现rhIFN-β1b结合抗体,4周后抗体滴度达最大值,不同剂量组间在结合抗体滴度方面未见明显的剂量-反应关系.同时,给药3周后血清中出现中和抗体,以后抗体滴度逐步升高.停药30d后,中和抗体滴度逐渐降低.结论:恒河猴重复给予rhIFN-β1b后,体内产生结合抗体和中和抗体,但给药组动物未观察到明显的病理学和生化指标异常,提示该生物制品重复使用是安全的.     

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子大鼠和Beagle犬的免疫原性

目的：在进行聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子（PEG30-rhG-CSF）大鼠和Beagle犬重复给药毒性试验时,观察给药后动物血清中抗PEG30-rhG-CSF抗体的产生和抗体的中和活性,为非临床安全性评价的确切性以及临床给药周期提供依据。方法：大鼠分为赋形剂对照组、PEG30-rhG-CSF0.75、3.0、12mg/kg组,sc给药,隔日1次,连续2周;Beagle犬分为赋形剂对照组、PEG30-rhG-CSF0.25、1.0和4.0mg/kg,sc,每周1次,连续4周。采用ELISA法检测动物血清中抗PEG30-rhG-CSF的抗体,采用NFS-60细胞/MTT比色法检测抗体的中和活性。结果：大鼠在给药期和恢复期各剂量组动物血清中均未检测到抗PEG30-rhG-CSF的结合抗体。Beagle犬在给药的第1周和第2周,未检测到结合抗体,但在第4周时,低、中和高3个剂量组各有5只（5/6）的动物血清中检测到结合抗体,而抗体滴度与剂量无明显相关性。恢复4周后,仅高剂量组1只（1/2）动物出现抗体,且抗体滴度呈下降趋势。另外,在给药期和恢复期,血清中所产生的抗体均无中和PEG30-rhG-CSF的活性。结论：大鼠重复给予PEG30-rhG-CSF的毒性试验中,所有动物血清中均未检测到结合抗体和中和抗体;Beagle犬用药组的绝大部分动物血清中出现抗PEG30-rhG-CSF的抗体,但所产生抗体无中和活性。     

ELISA法定量测定食蟹猴血清中的抗CTLA-4单克隆抗体

目的:建立酶联免疫吸附法(ELISA法)用于测定食蟹猴血清中的抗CTLA-4单克隆抗体(伊匹单抗,YERVOY?)的浓度.方法:建立间接ELISA方法对待测抗体药进行浓度测定,将Human CTLA-4蛋白包被于酶标板中,封闭后加入稀释后样品,采用HRP标记的羊抗人IgG作为酶标抗体,用TMB底物进行显色并用2 mol...     

ELISA法测定小鼠血清中流脑抗体效价

目的采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)测定流脑疫苗效价,同时为提高效价测定的准确度,选定包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比,为疫苗效价测定提供科学依据。方法分别以不同浓度C群多糖抗原液为包被抗原,以稀释过的免疫小鼠血清为待测抗体,采用ELISA间接测定法测定抗体效价,寻求包被抗原最佳工作浓度;然后包被抗原在其最佳工作浓度下包被酶标板,以不同稀释比的免疫小鼠血清为待测抗体,测定血清中抗体效价,寻求待测血清最佳稀释比;最后在包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比下,测定小鼠血清中流脑抗体的效价。同时检测该方法的特异性、稳定性和重复性。结果 ELISA测定流脑疫苗效价的包被抗原最佳工作浓度及待测血清最佳稀释比分别为160μg/mL和1∶4,同时该浓度下测定的免疫小鼠血清中流脑疫苗抗体效价为(1.274±0.003),阳转率为100%。说明该批疫苗产品合格(判定标准:阳转率≥90%)。批内批间变异系数均<7%,表明该测定技术具有良好的稳定性和重复性。结论建立了一种灵敏、特异、简便易行的ELISA法检测流脑疫苗效价,为流脑的预防、控制和诊断提供了一种技术手段。     

小鼠血清乙型肝炎病毒前S1抗体间接ELISA检测方法的建立和验证

目的  建立小鼠血清乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）前S1抗体的间接ELISA检测方法。方法  以合成的HBV前S1（21-47位氨基酸）多肽包被酶标板,利用方阵滴定法确定间接ELISA方法的最适工作条件,对该法的精密度、特异性和灵敏度进行验证,并与商品化试剂盒进行比较。结果  确定最佳抗原包被浓度为1.0 mg/L,血清稀释度为1︰10。该方法的特异性、灵敏度和精密度均符合检测要求。本法与商品化前S1抗体检测试剂盒测定结果的符合率为98.0%。结论  成功建立了HBV前S1抗体间接ELISA方法,可用于小鼠血清中前S1抗体的检测。     

重组集成干扰素α在不同动物长期毒性实验血清中中和抗体的产生及活性研究

目的研究重组集成干扰素α在金黄地鼠和猕猴长期毒性实验血清中中和抗体的产生及抗体活性的强弱。方法将金黄地鼠与猕猴分别分为10、30、100μg/kg与1、10、100μg/kg3个剂量组,均每日皮下注射重组集成干扰素α1次,各连续用药60、30d,取给药期和恢复期不同时间的血清,采用细胞病变抑制法进行检测。结果金黄地鼠的30、100μg/kg剂量组与猕猴的3个剂量组从给药第3wk起,在血清中检测到具有中和活性的抗体,抗体滴度在给药第4wk或恢复期第1wk达最高峰,并持续到恢复期结束。其中,猕猴10、100μg/kg剂量组的中和活性高于同期1μg/kg剂量组,10、100μg/kg剂量组之间则无显著性差异(P>0.05),1μg/kg剂量组在恢复期结束时已检测不到中和活性。结论金黄地鼠和猕猴重复注射重组集成干扰素α,血清中均能检测到中和抗体(低剂量组除外),抗体滴度和持续时间与注射剂量呈正相关。     

抗康柏西普抗体筛选用ELISA检测方法的建立

目的:为评价康柏西普免疫原性,建立一种恒河猴血清中的抗康柏西普抗体检测方法。方法:建立一种以康柏西普为包被蛋白、羊抗人Ig G Kappa light chain抗体为检测抗体的ELISA检测方法,并验证其精密度和专属性。同时运用细胞增殖实验确定阳性样品抗康柏西普抗体的活性。结果:所建立的检测方法最佳包被浓度为5μg·m L-1,检测抗体的最佳稀释倍数为2 500倍。阳性判断阈(cut point)为0.162,批内和批间变异系数均未超过15%。康柏西普浓度在小于10μg·m L-1时对检测无干扰。24个血清样品中,抗康柏西普抗体阳性率为62.5%,HUVEC细胞增殖实验显示无阳性血清具有中和康柏西普生物学活性的能力。结论:经验证,该方法可应用于抗康柏西普抗体的检测,为临床前及临床研究提供支持。     

联合酶联免疫的微量病毒中和法检测大流行流感疫苗血清中和抗体的可行性研究

目的:建立联合酶联免疫的微量病毒中和法(ELISA-MVN法),用于大流行流感疫苗流感病毒中和抗体效价的检测,并进行方法学验证。方法:采用4种羊抗流感病毒血清参考品,与人感染禽流感H5N1病毒疫苗株(A/Vietnam/1194/2004-NIBRG-14)病毒液,分别于37℃孵育18 h后,固定细胞,ELISA检测细胞内流感病毒核蛋白表达,确定其中和抗体效价,考察该方法的特异性;通过对高中低不同抗体滴度的血清样本的多次平行检测来评价该方法的重复性;通过ELISAMVN法和血凝抑制试验(HI试验)分别检测大流行流感疫苗接种者血清样本,比较2种方法的灵敏性和相关性。结果:ELISA-MVN结果显示羊抗H5N1的血清中和抗体检测滴度为5 120,其他3种血清的中和抗体滴度小于10,该方法特异性良好;采用ELISA-MVN法对3种不同滴度的血清进行重复检测,组内重复性试验的6次平行试验结果的RSD为3.5%。组间重复性5次结果,RSD为4.8%~8.6%。2种方法测定疫苗接种者血清样本抗体效价的结果具有显著相关性(P<0.001),相关系数r=0.932。ELISA-MVN法检测结果的几何平均滴度高于HI试验检测结果,该方法较HI试验在检测大流行流感疫苗血清样本灵敏度高。结论:ELISA-MVN可满足大流行流感疫苗血清学检测的要求,并可用于评价大流行流感疫苗的免疫效果。     

大鼠肺炎支原体感染的ELISA实验研究

目的 探讨支原体感染大鼠的血清抗体反应及其间接ELISA检查与诊断方法.方法 将肺炎支原体疫苗分别以滴鼻、腹腔注射、尾静脉注射方式免疫大鼠,收集动物血清,以方阵滴定法和间接法确立ELISA检测实验的最适条件,用间接法检测不同方法与时间免疫动物的血清特异性IgG抗体.结果 ELISA系统的最适工作条件包括抗原包被浓度10×10-4g/ml、血清稀释度1:40、酶结合物1:5000.以该系统检测滴鼻免疫大鼠共21只,免疫6次2只大鼠血清抗体阳性(66.67%),免疫7次后阳性率达100%;腹腔免疫和静脉免疫大鼠各18只,免疫2次后2只大鼠可检出特异性抗体(66.67%),免疫5次后全部动物均为血清抗体阳性(100%).结论 肺炎支原体0.0016g/只以滴鼻、腹腔注射、尾静脉注射的方法均能够使大鼠产生特异性抗体,以间接ELISA检测法检查腹腔免疫组和静脉免疫组大鼠血清免疫2次后即有部分大鼠血清抗体检测即呈阳性,5次后阳性率达100%,而滴鼻免疫组大鼠直至免疫6次后部分血清抗体检测才可呈阳性其阳性率与腹腔免疫和静脉免疫2次阳性率相当.间接ELISA法可有效检测支原体感染动物的血清特异性抗体,是一种具有较高特异性的快速简便方法.     

HSV-1载体在小鼠及猴体内抗体检测方法的建立

目的为了对以HSV-1为载体的基因工程产品在动物体内药物安全评价检测抗体的需要建立一套ELISA检测方法。方法将重组HSV-1抗原作为包被抗原,对HSV-1抗原的最佳包被稀释度、包被效率、阴性和阳性血清标本的最佳稀释度进行了考察。并根据建立的检测方法,对2种动物(Balb/c小鼠和恒河猴)在给予HSV-1载体后得到的阴性血清(小鼠:30份;恒河猴:24份)和阳性血清(小鼠:120份;恒河猴:96份)进行了血清抗HSV-1抗体检测。结果(1)HSV-1抗原的最佳包被稀释度为1∶800(4.5μg),包被效率为82%;(2)阴性和阳性血清标本的最佳稀释度均为1∶100;(3)用所建立的检测方法,能够较好的在小鼠和恒河猴的阳性血清中检测出抗HSV-1的抗体。结论该方法能全面满足以HSV-1为载体的基因工程产品在药物安全评价中抗体的检测需要,该检测方法的建立能够为该类产品或相关基因工程产品的药物安全评价研究中抗体的检测分析提供一定的参考依据。     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。     

Application of a bridging ELISA for detection of anti-erythropoietin binding antibodies and a cell-based bioassay for neutralizing antibodies in human sera

Although erythropoietin (EPO)-related pure red-cell aplasia (PRCA) is a rare disorder, attention still needs to be paid because underline mechanism of EPO immunogenicity is various and controversial. Among several assay systems for screening of anti-EPO binding antibodies (Abs), we adopted and setup the bridging ELISA using streptavidin-coated plate. To test their neutralizing activities, cell-based neutralizing (NT) bioassay was setup. When we analyzed serum samples by using these two assays, we found two positive results in the two samples. In the sample 1, 411.9 ng/ml of anti-EPO Abs were found and neutralizing activity of 36.2% at 1:5 serum dilution was detected. In the sample 2, 40.5 ng/ml of anti-EPO Abs were found and neutralizing activity of 96.7% was detected. Our results indicate that the higher anti-EPO antibody (Ab) level in a serum does not always lead to the stronger neutralizing activity. This report gives crucial consideration to the needs of establishing clear criteria to link various assay parameters with the onset of PRCA and its progression.     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。     

Twenty-six-week repeat-dose toxicity study of a recombinant human granulocyte colony-stimulating factor derivative (nartograstim) in cynomolgus monkeys.

An rhG-CSF derivative, nartograstim (NTG), at dose levels of 0 (saline), 0.1, 1, 10, and 100 microg/kg, was administered subcutaneously to groups of 3 male and 3 female cynomolgus monkeys once daily for 26 weeks to investigate its toxicity. In Week 4 or later, an increase in leukocyte counts consisting mainly of neutrophils was noted in all NTG dose groups, and was considered to be attributable to the pharmacological action of NTG. The degree of this increase was reduced with repetition of dosing. Increases in granulocytic cells and granulocytic cells/erythrocytic cells (G/E) ratio in the bone marrow, increase in serum ALP activity, and enlarged spleens with increase of neutrophils in the red pulp were observed at 10 microg/kg and higher. Anemia was noted at 10 microg/kg and higher in Week 4 and was accompanied by an increase in reticulocytes and a decrease in total cholesterol level at 100 microg/kg. Anti-NTG antibody was detected in 1 female at 100 microg/kg, but neutralizing antibodies were not detected at any dose levels in Week 4. In Weeks 13 and 26, these antibodies were detected sporadically at all dose levels. However, there were considerable individual variations in antibody titer, and no definite correlation could be found between the dose levels and the antibody titer. Seven NTG-dosed animals including 3 high dose-group animals showed obvious increases in leukocyte counts until Week 26 but no obvious elevation of anti-NTG or neutralizing antibody. In these animals, changes including anemia became slighter but were still observed in Week 26. Under the conditions in this study, 1 microg/kg was concluded to be the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) in cynomolgus monkeys.     

Evaluation of an immunoassay for human-specific quantitation of therapeutic antibodies in serum samples from non-human primates

Pharmacokinetic characterization of therapeutic antibodies plays an important role during preclinical and clinical development. However, accurate pharmacokinetic evaluation of therapeutic antibodies in serum samples from non-human primates is often complicated by insufficient specificity of the assays to measure drug levels. The present paper describes the use of a murine monoclonal antibody in an immunoassay format to specifically and quantitatively measure human therapeutic antibodies in serum from non-human primates. This murine antibody is directed against a unique epitope on the constant region CH2 domain of all isotypes of human immunoglobulin G (IgG). The antibody, designated anti-human Fcγ-pan: R10Z8E9, does not cross-react with serum from mouse, rat, and the non-human primates marmoset, rhesus macaque, cynomolgus monkey and baboon when using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or surface plasmon resonance technology (Biacore) format for measurement of the therapeutic antibody. Use of the antibody anti-human Fcγ-pan: R10Z8E9 as capturing and detection reagent allowed human-specific quantitation of total therapeutic antibody anti-IGF-1R in spiked cynomolgus monkey serum via a Sandwich ELISA format. In contrast, a commercially available polyclonal antibody (PAB) directed to the Fcγ fragment of human IgG only specifically measured the therapeutic antibody in buffer samples, but not in serum from cynomolgus monkeys. This generic human IgG assay was already applied in several pharmacokinetic studies in cynomolgus monkeys to determine serum levels of different therapeutic antibodies, including the anti-IGF-1R. Validation of the assay for a humanized IgG1 therapeutic antibody against a membrane protein revealed a lower limit of quantitation of 8 ng/mL in undiluted serum. Intra-assay and inter-assay precision was characterized by a coefficient of variation of less than 10% and accuracy was within 15%. Dilutional linearity was evidenced by a recovery of 98.7–114% of expected concentrations. In conclusion, the monoclonal antibody anti-human Fcγ-pan: R10Z8E9 provides a standard means for human-specific quantitation of therapeutic antibodies with high sensitivity in serum samples from non-human primates in a generic human IgG assay.     

间接ELISA测定血清中RI含量方法的建立

目的：建立检测血清中核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease Inhibitor，RI）含量的问：陵酶联免疫吸附法（EUSA），并分析该方法的特异性和敏感性。方法：用血清样品包被酶标板，兔抗人RI抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为二抗，建立血清RI定量检测的间接EUSA法。结果：所建立的用于血清中RI含量检测的间接ELISA方法特异性好．灵敏度高。结论：间接ELISA法可以用于测定血清中的RI抗原含量，具有良好的灵敏度和稳定性，能够有效的反映出人血清中的RI表达情况。