稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

益心解毒方对Nox2和Nox4亚基过表达的心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响

目的通过观察益心解毒方含药血清对Nox2、Nox4亚基过表达的H9c2心肌细胞NADPH氧化酶活性的影响,揭示其作用环节是否与干预相应亚型的NADPH氧化酶调控环节有关。方法采用PCR方法扩增Nox2、Nox4基因全长序列,经双酶切、连接载体和转化后提取重组质粒,经酶切鉴定的阳性质粒进行DNA测序,测序正确后按照lipofectamine 2000试剂的说明书瞬时转染H9c2细胞,转染后的心肌细胞分组给予不同的药物干预,24 h后检测NADPH氧化酶活性。结果 1含有Nox2/Nox4亚基的重组质粒载体通过测序鉴定,结果与Gen Bank报道的完全一致。2通过荧光显微镜下观察转染72 h后的H9c2细胞,可见大量发绿色荧光的细胞,流式细胞术计数结果显示转染率均在60%左右,符合实验要求。3空质粒载体组、模型组、益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达明显高于正常组(P<0.01,P<0.05);模型组和益心解毒方组的NADPH氧化酶活性表达高于空载体组(P<0.01);模型组NADPH氧化酶活性表达均明显高于其他各组,而益心解毒方各组的NADPH氧化酶活性表达均明显低于模型组(P<0.01,P<0.05)。结论成功构建大鼠心肌细胞Nox2、Nox4亚基的重组质粒载体,该重组质粒载体可以在心肌细胞中过表达,益心解毒方可以有效地降低NADPH氧化酶活性的表达。提示此复方治疗心衰的机制可能是抑制了Nox2和Nox4型NADPH氧化酶的表达。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

骨形成蛋白7能减轻TGF-β1诱导的人足细胞损伤

目的：观察骨形成蛋白（bone morphogenie protein 7,BMP-7）抑制转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导的人足细胞转分化作用及其机制研究。方法：构建及鉴定pcDNA 3.1rh BMP-7质粒,体外培养人足细胞,先后予10、20、50、100、200 μg/mL重组的BMP-7诱导足细胞,分别在培养24、48、72 h收集细胞,流式细胞试验检测细胞凋亡率,以此选择重组BMP-7最适的刺激浓度和最适的作用时间点。实验分为正常对照组、TGF-β诱导组（TGF-β）及质粒转染组（PEGF-BMP-7）,质粒转染组加入重组BMP-7 100 μg/mL预处理48 h后,而TGF-β诱导组和PEGF-BMP-7组分别予5 ng/mL TGF-β1处理足细胞后,通过免疫荧光观察足细胞Podocin、α-SMA、VIM的表达变化;收集细胞抽取总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western blot观察重组BMP-7对人足细胞Podocin、α-SMA、VIM的mRNA和蛋白表达的影响。结果：①本实验成功构建pcDNA 3.1rh BMP-7质粒,转染的人足细胞能稳定表达BMP-7,质粒转染组BMP-7蛋白表达水平（0.487±0.012）较正常对照组（0.251±0.012）和TGF-β诱导组（0.151±0.015）明显增高（P＜0.001）;②Real-time PCR检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的mRNA表达水平（0.285±0.013）较正常对照组（1.057±0.090）明显降低（P＜0.001）,而质粒转染组足细胞Podocin的mRNA表达水平（0.693±0.077）较TGF-β诱导组有升高趋势（P=0.003）;TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA（1.257±0.039和1.028±0.093）、VIM（1.114±0.097和0.821±0.059）的mRNA表达较正常对照组（0.357±0.089和0.403±0.020）明显升高（P＜0.001）,质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的mRNA较TGF-β诱导组有下降趋势（P=0.011,P=0.002）。Western blot检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的蛋白表达水平（32.923±5.301）较正常对照组（101.807±9.208）明显降低（P＜0.001）,而质粒转染组足细胞Podocin的蛋白表达水平（90.507±7.810）较TGF-β诱导组有升高趋势（P＜0.001）;TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA（116.120±8.300和93.832±10.602）、VIM（124.016±9.702和100.801±6.801）的蛋白表达较正常对照组（35.730±4.892和43.801±2.600）明显升高（P＜0.001）,质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的蛋白较TGF-β诱导组有下降趋势（P=0.017,P=0.007）。结论：TGF-β1可诱导人足细胞发生转分化,导致其α-SMA、VIM表达增高,Podocin表达减少,BMP-7能显著抑制此现象,提示BMP-7可逆转足细胞EMT,对足细胞损伤具有保护作用。     

苓桂术甘汤含药血清对TGF-β1诱导的大鼠心肌细胞H9c2中TNF-α、IL-6和IL-1β的影响*

目的〓观察苓桂术甘汤（Linggui Zhugan decoction,LGZGD）含药血清对转化生长因子-β1（Transforming growth factor,TGF-β1）诱导的大鼠心肌细胞H9c2损伤的保护作用。方法〓分别使用10％的空白大鼠血清、LGZGD小、中、大剂量组含药血清和大鼠心肌细胞H9c2共培养,12 h后加入20 ng·mL-1的TGF-β1建立大鼠心肌细胞损伤模型,继续培养12 h后采用ELISA法检测细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。结果〓与正常组比,TGF-β1组TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明显升高（P<0.01）,与TGF-β1组比,LGZGD 4.2,8.4 g·kg-1组的TNF-α的含量显著下降,分别由（323.839±35.614）下降至（191.399±43.203）和（175.030±19.589）ng·L-1（P<0.05、P<0.01）;LGZGD 4.2,8.4 g·kg-1组的IL-6的含量由（67.171±13.506）下降至（40.490±7.899）（30.548±2.226）ng·L-1（P<0.05、P<0.01）,LGZGD 2.1,4.2,8.4 g·kg-1组的IL-1β含量由（23.463±3.053）下降至（14.793±4.244）、（14.600±3.517）和（9.253±2.720）ng·L-1（P<0.05、P<0.01）。结论〓LGZGD含药血清对TGF-β1诱导的大鼠心肌细胞H9c2的损伤有显著的保护作用。     

腺病毒介导vasostatin-1基因转染表达对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:构建并鉴定携带人嗜铬粒蛋白A的N端1~76片段(CGA1-76) 即vasostatin-1（VS-1）基因的腺病毒表达载体,观察重组腺病毒在大鼠心肌细胞中的表达,探讨VS-1转基因治疗对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:（1）利用CGA1-58cDNA模板,设计引物,利用PCR合成、扩增CGA1-76的cDNA并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack,经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒pAd-VS-1线性化后转染QBI-293A细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad-VS-1,将该病毒感染大鼠心肌细胞H9c2并通过蛋白质印迹法检测其表达。（2）建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型,分为4组:空白组、H/R组、空载腺病毒转染+H/R组、Ad-VS-1转染+H/R组;测定各组心肌细胞活力,超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果:（1）经PCR、基因测序、酶切鉴定证实重组质粒pAd-VS-1构建成功,将其导入QBI-293A细胞,通过蛋白质印迹法证实病毒颗粒Ad-VS-1感染心肌细胞后VS-1蛋白表达。（2）H/R组心肌细胞活力和SOD含量较空白组明显降低,MDA增加;而VS-1基因转染提高了心肌细胞H/R模型心肌细胞活力和SOD含量,并降低了MDA生成量。结论:成功构建Ad-VS-1,将其感染大鼠心肌细胞后能够表达VS-1并对心肌细胞H/R损伤具有保护作用,其机制和抗氧化作用有关。     

白介素1受体相关激酶4重组过表达质粒pcDNA3.1-IRAK4的构建及转染

目的构建重组过表达质粒pc DNA3.1-IRAK4并检验其在H9c2细胞中的表达。方法在全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene申请到p DONR223-IRAK4质粒菌种,摇菌提取质粒后测序。设计引物将目的片段扩增并跑胶回收。将目的片段PCR扩增产物和空质粒pc DNA3.1采用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切,构建重组表达质粒。将重组质粒使用两种转染试剂转染入H9c2细胞中,并借助Western blot法检测IRAK4蛋白在H9c2细胞中的表达。结果重组过表达质粒经菌落PCR、序列测定证实,扩增基因片段IRAK4与基因数据库中序列一致,并且含有终止密码子。转染入H9c2细胞中能够过表达,表明IRAK4重组过表达质粒构建成功。结论成功构建IRAK4基因过表达重组质粒,获得外源性IRAK4转染的H9c2细胞。     

骨形成蛋白-7基因转染对人肾小管上皮细胞外基质分泌的影响

目的构建骨形成蛋白-7(BMP-7)全长基因表达质粒,观察BMP-7过表达对转化生长因子(TGF)-β诱导的人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌(ECM)的作用。方法将BMP-7全长cDNA连接进入真核细胞表达质粒pcDNA3·1中,以脂质体Superfect介导的方法将重组表达质粒pcDNA3·1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞,挑选阳性克隆,以获得稳定转染的人肾小管上皮细胞株。采用Western印迹方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞培养上清液中的表达。给予TGF-β(5ng/ml)进行处理,应用RT-PCR和ELISA的方法,观察BMP-7过表达对纤维粘连蛋白(FN)、胶原Ⅰ、Ⅲ(ColⅠ、Ⅲ)等细胞外基质mRNA和蛋白质表达的作用。结果EcoR I限制性酶切鉴定以及DNA双向测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7全长基因表达质粒。Western印迹方法检测稳定转染人肾小管上皮细胞蛋白表达量明显高于空载体转染组(P<0·05)。TGF-β处理24、48、72h后,5ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3·1)+5ng/ml TGF-β组ColⅠ、Ⅲ、FN mRNA的表达量明显高于正常对照组,空白质粒转染组(pcDNA3·1)[ColⅠ(A值):0·897±0·100、1·054±0·090vs0·286±0·010、0·319±0·080;ColⅢ(A值):1·114±0·040、0·961±0·090vs0·354±0·020、0·403±0·040;FN(A值):1·257±0·090、1·188±0·060vs0·413±0·020、0·454±0·060,均P<0·05];Col I、FN mRNA表达量pcDNA3·1-BMP-7转染组+5ng/ml TGF-β组明显低于TGF-β处理组(0·591±0·007、0·687±0·020,P<0·05),ColⅢmRNA表达有降低趋势(0·809±0·090),但差异无统计学意义。细胞培养上清液FN含量5ng/ml TGF-β处理组、空白质粒转染(pcDNA3·1)+5ng/mlTGF-β组明显高于正常对照组(P<0·05),而pcDNA3·1-BMP-7转染组+5ng/ml TGF-β组表达明显低于TGF-β处理组(P<0·05)。结论BMP-7过表达可以显著减少TGF-β所致的人肾小管上皮细胞FN、ColⅠ、ⅢmRNA和细胞培养上清液中的FN的表达。表明BMP-7减少小管间质炎症反应和纤维化的发生,改善肾功能的作用,部分是通过抑制肾小管上皮细胞分泌细胞外基质实现的。     

靶向沉默转化生长因子β1表达的短发夹RNA的筛选

目的:筛选可靶向沉默转化生长因子β1(TGF-β1)表达的短发夹RNA(shRNA)。方法:设计和制备靶向沉默TGF-β1的5条shRNA,并构建靶向沉默TGF-β1的p-Genesil-shRNA真核表达重组质粒及含无关shRNA的pGenesil-1-shRNA-vect对照质粒,酶切和测序方法进行鉴定。通过脂质体介导分别将p-Genesil-1-shRNA-vect质粒和各重组表达质粒转染入高糖或AngⅡ环境激活的HKC细胞(分别命名为p-Genesil-1-vect细胞及p-Genesil-shRNA1~5细胞),Western blot方法检测沉默TGF-β1表达的效果。结果:酶切和测序结果显示,5种重组质粒均可切出与预计相符的目的片段,所有shRNA编码序列与设计一致。与HKC细胞相比,高糖或AngⅡ刺激的HKC细胞和pGenesil-1-vect细胞中TGF-β1表达均增高(F=74.188,P<0.001),而后二者之间TGF-β1表达差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖或AngⅡ刺激的p-Genesil-1-vect细胞相比,高糖或AngⅡ刺激的各组p-Genesil-shRNA细胞中TGF-β1表达均降低(F=139.695,P<0.001)。结论:筛选出1条可靶向沉默TGF-β1表达的shRNA。     

氟伐他汀对心肌细胞凋亡的调控作用及其可能机制研究

目的 以大鼠胚胎来源的心肌细胞为模型,观察氟伐他汀对心肌细胞凋亡的调控作用,并探讨其可能机制.方法 通过MTT检测法检测细胞活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用实时定量PCR以及Western Blot方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体的表达.结果 氟伐他汀能够以浓度依赖性的方式降低H9c2细胞的活性,10 μM 氟伐他汀处理H9c2细胞后其凋亡率增加,处理4 d后H9c2细胞凋亡率为54.9%;氟伐他汀能够上调 TβRⅡ mRNA 和蛋白的表达,而对TGF-β1及TβRⅠ的表达无明显的上调作用.结论 氟伐他汀能够诱导H9c2细胞的凋亡,这种凋亡诱导作用可能与氟伐他汀对TβRⅡ的上调作用有关.     

miR-133a真核表达载体的构建及转染大鼠心肌H9C2细胞

目的:构建miR-133a真核表达载体后,体外转染大鼠H9C2心肌细胞.方法:设计并合成DNA模板引物,用T4 DNA 连接酶将pre-miR-133a连接到线性化的PgenesIL-1.1质粒中,对重组质粒进行酶切及测序鉴定.以LipofectamineTM 2000 Reagent将鉴定正确的重组质粒瞬时转染H9C...     

人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。     

转化生长因子β1基因转染人肝癌细胞及其对MMP-2，9表达的影响

目的通过对人肝癌细胞株(SMMC-7721)转染TGF-β1基因,观察该细胞MMP-2,9表达的变化。方法用电穿孔法进行基因转染,并经Westernblot,Northernblot法作鉴定,后分别应用Northernblot,Westernblot法观察该细胞株表达MMP-2,9mRNA和MMP-2蛋白的变化。结果经转染TGF-β1基因的细胞株MMP-2mRNA和蛋白表达均高于对照组,但MMP-9mRNA表达则没有变化。结论TGF-β1可促进肝癌细胞MMP-2表达,表明TGF-β1可能在肝癌发生浸润和转移过程中也发挥重要作用。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

AM12质粒对体外肾小管上皮细胞凋亡和分泌转化生长因子-β_1的影响

目的观察AM12质粒(含乙型肝炎病毒3.2 kb全基因组)对体外培养的人近端肾小管上皮细胞HK-2凋亡和分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。方法以体外培养的HK-2细胞为对象,以AM12质粒转染HK-2细胞为转染组,以正常HK-2细胞作为对照组,用流式细胞仪检测细胞的凋亡及Fas表达率;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中TGF-β1的浓度。结果转染组HK-2凋亡率为(1.49±0.02)%,高于对照组的(1.03±0.09)%(P<0.05);Fas表达率为(10.09±2.34)%,高于对照组的(6.58±0.65)%(P<0.05);上清液TGF-β1水平为(283.85±61.12)ng.L-1,高于对照组的(210.28±47.21)ng.L-1(P<0.05)。结论 HBV-DNA质粒转染体外培养的人肾小管上皮细胞可诱导其凋亡并上调其对TGF-β1的分泌。     

稳定表达DLC-1的淋巴瘤细胞株模型的建立

目的 建立稳定表达肝癌缺失基因-1(DLC-1)的淋巴瘤细胞株.方法 将DLC-1真核表达质粒转染人淋巴瘤细胞株Raji,G418筛选,对获得的Raji细胞株进行Western blot鉴定.结果 酶切和测序鉴定DLC-1的cDNA片段正确插入pcDNA3.1质粒,Western blot鉴定转染后Raji细胞株DLC-1高表达.结论 成功建立了稳定高表达DLC-1的淋巴瘤细胞株.     

miR-21-5p靶向TGF-β1调节大鼠心肌细胞增殖和凋亡

目的 探讨miR-21-5p通过调控转化生长因子-β₁(transforming growth factor-β₁,TGF-β₁)对大鼠心肌细胞H9c2增殖和凋亡的影响。方法 抑制或过表达TGF-β₁后,通过RT-qPCR检测H9c2细胞中miR-21-5p的表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-21-5p和TGF-β₁的靶向关系,CCK-8及Annexin V-FITC/PI检测H9c2细胞增殖和凋亡,Western blotting检测H9c2细胞中TGF-β₁的表达水平。结果 miR-21-5p表达抑制后使H9c2细胞增殖受到抑制并诱导其凋亡(P＜0.05)。miR-21-5p靶向负调控TGF-β₁的表达水平(P＜0.05)。过表达TGF-β₁显著抑制H9c2细胞增殖并诱导其凋亡(P＜0.05)。结论 miR-21-5p通过靶向下调TGF-β₁的表达水平,促进大鼠H9c2心肌细胞增殖和抑制细胞凋亡。     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

Notch1 miRNA干扰质粒构建及功能鉴定

目的设计及构建大鼠Notch1微小干扰核糖核酸(miRNA)干扰质粒,最终筛选出效果最好的干扰质粒。方法针对大鼠Notch1基因分别设计3对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒,基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光确定转染效率,Western blot检测3对干扰质粒、阴性对照质粒对Notch1胞内结构域(N1ICD)表达的影响。结果测序表明,Notch1干扰序列及读码框完全正确,荧光显微镜观察H9c2心肌样细胞miRNA瞬时转染效率在80%左右。Western blot显示miRNA6637对Notch1干扰效果最强。结论成功构建大鼠Notch1 miRNA的有效干扰质粒,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝纤维化细胞模型胶原合成及沉积的影响

目的 观察重组转化生长因子β3(TGF-β3)基因对大鼠肝纤维化细胞模型胶原合成及沉积的影响.方法 (1)构建质粒pcDNA3.1(+)-TGF-β3和pcDNA3.1(+)-TGF-β1.(2)将pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染大鼠肝星状细胞(HSC)-T6,经G418筛选建立稳定高表达TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆.(3)pcDNA3.1(+)-TGF-B3转染HSC-T6阳性细胞克隆,荧光实时定量PCR法检测TGF-β3mRNA的表达;荧光实时定量PCR法及Western印迹法分别检测TGF-β3、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA和蛋白表达情况.结果 (1)pcDNA3.1(+)-TGF-β3和pcDNA3.1(+)-TGF-β3质粒均可转染HSC-T6细胞,以转染48 h时转染效率最高,达28.2%.(2)pcDNA3.1(+)-TGF-β3转染HSC-T6细胞阳性克隆后,与单纯阳性克隆组相比,TGF-β1mRNA表达无明显改变,而蛋白表达明显低(0.48±0.07 vs 0.66±0.14,P=0.023);Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达明显低(mRNA:7.2±1.0 vs 13.7±0.4,P=0.010,蛋白:0.45±0.21 vs 0.82±0.13,P=0.041),MMP-2 mRNA及蛋白较低,但差异无统计学意义(均P>0.05),MMP-9 mRNA及蛋白表达明显多(均P<0.05),TIMP-1 mRNA及蛋白表达明显低(均P<0.05).结论 (1)重组TGF-β3真核表达载体构建正确,在转染阳性克隆细胞48 h后获得高效表达;(2)稳定高表达TGF-B1的HSC-T6细胞阳性克隆可作为肝纤维化细胞模型;(3)pcDNA3.1(+)-TGF-β3转染阳性克隆能减少胶原合成,并通过调节基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达对胶原沉积起抑制作用.