类风湿关节炎滑膜CD68阳性细胞筛选的意义

目的:探讨用CD68作为细胞标志筛选类风湿关节炎和正常滑膜组织中的滑膜巨噬细胞CD68+细胞,并观察筛选后细胞的活性及特性。方法:滑膜组织来源于2003-02/2004-03南方大学南方医院脊柱骨病科收治的12例住院患者。类风湿关节炎组6例源自全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术的类风湿关节炎患者,正常滑膜组6例来自无关节炎病史的半月板损伤患者,均经病理诊断证实。从滑膜组织中分离滑膜细胞,免疫磁珠法筛选滑膜CD68+和CD68-细胞,用流式细胞仪检测筛选效能;用免疫组化染色观察类风湿关节炎组和正常滑膜组筛选前后滑膜CD68+细胞所占比例;以四甲基偶氮唑盐比色法观察筛选后细胞体外培养增殖活性。结果:所获12例滑膜组织全部进入结果分析。①滑膜细胞分离后观察:滑膜细胞24h后贴壁生长,滑膜巨噬样细胞在类风湿关节组的比例较正常滑膜组高。②筛选后滑膜细胞的观察结果:免疫磁珠法筛选的CD68+和CD68-细胞均在2h内开始贴壁,24h后CD68-细胞呈极向排列生长,贴壁能力强于CD68+细胞。筛选后的滑膜CD68+细胞与磁珠结合在一起,具有巨噬样细胞形态,胞周可有突起,分裂增殖较慢,但在体外能传数代;CD68-细胞未与磁珠结合,表现为长梭形成纤维细胞样形态,细胞分裂增殖迅速。③CD68+细胞的纯度分析:经流式细胞仪分析细胞纯度为93.6%,主峰右移,细胞平均体积增大。滑膜CD68-细胞不能被FITC标记。④滑膜细胞CD68的表达观察:筛选后CD68+细胞均为棕黄色。细胞核大、较疏松,细周有突起。CD68-细胞基本为成纤维样细胞,胞浆未被黄染,细胞核位于细胞中央,呈卵圆形,核仁明显。⑤两组滑膜细胞体外增殖速度:在体外均有不同程度增殖活性。类风湿关节炎和正常滑膜CD68-细胞增殖速度快于同一组织来源滑膜CD68+细胞的增殖速度[(0.680±0.047),(0.236±0.014);(0.605±0.031),(0.195±0.019);t=21.989,P<0.05]。类风湿关节炎滑膜CD68+细胞增殖速度快于正常滑膜CD68+细胞的增殖速度[(0.236±0.014),(0.195±0.019);t=4.149,P<0.05]。结论:CD68可作为一种标志来筛得滑膜细胞中的巨噬细胞和其他滑膜细胞,筛选后滑膜细胞均具有良好增殖活性。CD68+细胞具有典型巨嗜样细胞形态,CD68-细胞主要为成纤维样细胞,两种细胞区分程度好有助于临床对疾病活动期和严重程度判断。     

苦豆子总碱对大鼠实验性结肠炎CD4^＋CD25^＋,CD8^＋CD28^-表达的影响

目的：观察苦豆子总碱对实验性结肠炎大鼠的外周血和结肠组织中调节性T细胞CD4^＋CD25^＋，CD8^＋CD28^-表达的影响。方法：实验于2006—03／08在南方医科大学实验室进行。①分组：将72只SD大鼠数字表法随机分成正常对照组，模型组，5-氨基水杨酸组，苦豆子15，30，60mg／kg组共6组，每组12只。②造模：除正常对照组外，其他5组采用三硝基苯磺酸灌肠法制备结肠炎大鼠模型，正常对照组给予等量生理盐水灌肠。③给药：造模第2天开始灌胃给药，2mL／只，1次／d。5-氨基水杨酸组灌胃5-氨基水杨酸400mg／kg，苦豆子15，30，60mg／kg组灌胃酸苦豆子总碱15，30，60mg／kg，其他2组灌等量生理盐水。④取材：在第1周和第3周各组分别取6只大鼠处死，测定结肠黏膜组织和外周血中CD4^＋CD25^＋，CD8^＋CD28^-的表达水平，观察苦豆子总碱对模型大鼠急慢性期T细胞亚群的影响。结果：72只大鼠进入结果分析。①建模第1周：模型组结肠内T细胞亚群CD4^＋CD25^＋，CD4^＋CD25＋／CD25^-，CD8^＋CD28^-及CD8^＋CD28^-／CD28^＋高于正常对照组（P〈0．05，0．01），苦豆子各剂量组数据虽低于模型组，但经统计学处理后差异不显著（P〉0．05）。②建模第3周：模型组大鼠外周血中的CD8^＋CD28和CD8^＋CD28^-／CD28^＋的表达高于正常对照组和苦豆子30，60mg／kg组[CD8^＋CD28：（11.3&;#177;1．3）％，（5．4&;#177;2．2）％，（5．8&;#177;3．2）％，（6．0&;#177;4．2）％；CD8^＋CD28^＋／CD28^＋：（1．2&;#177;0．8）％．（0．4&;#177;0．1）％，（0．5&;#177;0．2）％，（0．5&;#177;0．4）％；P〈0．05，0．01]；结肠组织中的CD8^＋CD28^-和CD8^＋CD28^-／CD28^＋的表达也高于正常对照组和苦豆子30，60mg／kg组[CD8^＋CD28^-：（17．4&;#177;4．2）％，，（3．8&;#177;4．5）％，（3．9&;#177;4．0）％．（4．2&;#177;3．6）％；CD8^＋CD28^-／CD28^＋：（1．8&;#177;0．3）％，（0．7＋0．3）％．（0．7＋0．2）％，（0．7&;#177;0．3）％：P〈0．05，0．01]。结论：苦豆子总碱30，60mrg／kg能下调实验性结肠炎大鼠慢性期高表达的CD8^＋CD28-T细胞。     

人脐血CD133^＋和CD133^-细胞分化为内皮细胞的实验研究

目的：从人脐血中分离鉴定、培养和诱导分化人脐血CD133^+细胞和CD133^+细胞，建立一种能够方便获得高纯度人脐血CD133细胞的方法，同时在体外诱导该细胞向内皮细胞分化，进一步明确CD133^+细胞与CD133^-细胞之间的关系。方法：从新鲜脐血中纯化的CD133^+和CD133^-接种于添加了干细胞因子(stem cell factor，SCF)，IL-3，IL-6的Sigma无血清培养液中，检测CD133^+细胞抗原标志，观察梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志。结果：免疫磁珠法分离的CD133^+细胞数为(6．08—6．80)&;#215;105，CD133^+细胞的纯度(96．18&;#177;1．83)％。CD133^-细胞(0．02&;#177;0．01)％。培养3—5d可观察到梭形贴壁细胞，15d左右可形成索条状结构，贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志血管内皮钙黏蛋白，血浆血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，UEA-1和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor eceptor-2，VEGFR-2)。结论：采用先用密度梯度离心法离心后再用免疫磁珠分选的方法来分离CD133^+细胞和CD133^-细胞，分离到的细胞纯度高，在一定的条件下，可分化为内皮样细胞。     

可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用

目的：分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。 方法：实验于2005-03／09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3^＋T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3^＋T淋巴细胞取自正常人的外周血，牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbieo公司。大肠杆菌内毒素购自Sigma公司，质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，加入大肠杆菌内毒素，实验组用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3^＋T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化；PeDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后，免疫组化染色强阳性表达，转染培养液培养实验组细胞24h和48h后，噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。 结果：①正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后，细胞活性降低；培养24h和48h后。噻唑蓝法检测各组的A值：正常牙周膜成纤维细胞和CD3^＋T淋巴细胞共培养组，加入内毒素刺激，24h为4．6&;#177;0．2，48h为3．7&;#177;0．1；用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，24h为7．8&;#177;0．3，48h为6．9&;#177;0．5；正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激，24h为9．0&;#177;0．4；48h为8．7&;#177;0．3；单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T细胞共培养，24h为10．1&;#177;0．2，48h为9．8&;#177;0．5；单纯培养牙周膜成纤维细胞，24h为10．0&;#177;0．5，48h为9．2&;#177;0．1。②转染空质粒PcDNA3．1（&;#177;）的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显，而转染质粒PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强。 结论：内毒素与T淋巴细胞刺激正常牙周膜成纤维细胞可以引起肿瘤坏死因子α水平升高；可溶性肿瘤坏死因子受体对于炎症牙周膜成纤维细胞有抑制肿瘤坏死因子α作用的功能。     

人骨髓来源的多能成体祖细胞分离纯化及体外培养的实验研究

目的：建立体外分选纯化人多能成体祖细胞(muhipotent adult progenitor cills from bone marrow，MAPCs)的方法，用自行配制的细胞培养基对MAPCs进行体外培养，了解其生长、增殖特性。方法：取健康志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞，对单个核细胞行贴壁培养后，将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45，Gly-A免疫微磁珠负分选，流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度；培养观察细胞生长情况，对传代到不同阶段的细胞进行流式细胞分析，初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性。结果：①通过免疫磁性分离(magnetic activated cell sorting，MACS)分选，平均每1&;#215;10^9L^-1骨髓贴壁细胞可分选出约(5．1&;#177;2．8)&;#215;10^7L^-1数量级的MAPCs，分选前后细胞活力分别为(96．7&;#177;1.7)％和(96．0&;#177;2．4)％，差异无显著性意义。②用自制的培养基培养分选后的MAPCs，细胞生长良好，最长传代到第16代。③流式细胞仪分析获取的CD45^-，Gly-A^-细胞纯度大于98％；流式细胞仪分析传代第4，8，12代MAPCs，CD45^-，Gly-A^-细胞纯度大于98％。结论：①CD45，Gly-A免疫微磁珠负分选可从骨髓细胞中分选出高纯度的MAPCs。②自行研制的人MAPCs培养基能成功体外培养MAPCs。     

骨髓CD34^＋细胞移植促进梗死心肌血管形成的实验研究

目的：研究骨髓CD34^+细胞移植对梗死心肌血管再生的作用。方法：用免疫磁珠法从犬肋骨骨髓分离CD34^+细胞并注射到CO2冷冻建立的慢性心肌梗死模型区，2，4，8周后取标本，应用免疫组化方法检测血管第八因子的表达，计数血管密度，分别于建立模型前、后4周和干细胞移植后8周应用。^99TC^m-甲氧基异丁基异腈(^99TC^m-MIBI)单光子计算机断层扫描对心肌血流灌注进行评价，计算放射性分布缺损计数(F值)。结果：骨髓CD34^+细胞移植2，4，8周后梗死区血管密度(200倍视野下数)分别为(3．2&;#177;1．2)，(8．2&;#177;0．8)，(12．7&;#177;2．2)条／视野，明显高于对照组(t=5．09，14．07，8．67，尸均&;lt;0．05)。骨髓CD34^+细胞移植前、后8周的心肌灌注显像F值分别为5．44&;#177;0．70，1．50&;#177;0．55。细胞移植后梗死区心肌血流灌注得到明显改善(t=10．84，P均&;lt;0．05)。结论：骨髓CD34^+细胞梗死心肌移植可明显促进梗死区血管形成，提高梗死区心肌的血流灌注。     

昆明山海棠与类风湿关节炎滑膜细胞体外增殖和凋亡

背景:昆明山海棠应用于类风湿关节炎治疗已被证实有确切疗效,但对于其作用机制目前尚不明确.目的:验证昆明山海棠对类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和成纤维样细胞体外增殖活性及对其凋亡影响,分析其剂量效应关系.设计、时间及地点:细胞学体外分组对照实验,于2003-08/2007-06在汕头大学医学院第一附属医院中心实验室和南方医科大学细胞生物实验室完成.材料:类风湿关节炎6例及正常滑膜组织3例,来源于汕头大学医学院第一附属医院骨科和南方医院脊柱骨病科患者术中获得的标本.昆明山海棠制备水提取液,含生药0.667 g/mL..方法:收集获得的滑膜组织,通过消化法获得原代类风湿关节炎及正常滑膜细胞,第2-4代细胞用免疫磁珠法筛选滑膜CD68~+细胞和CD68~-细胞,在接种72 h后加入实验各组分别在培养液中加入最终体积分数分别为5,10,20 mL/L的昆明山海棠药液处理24 h和48 h.同时设立不加药物的阴性对照及不加细胞空白对照.主要观察指标:相差倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,用MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞仪检测和TUNEL.法检测细胞凋亡.结果:分选后滑膜CD68~-细胞为成纤维样细胞,滑膜CD68~+细胞为滑膜巨噬样细胞.施予干预因素后,各组有部分细胞体积缩小,胞膜皱缩,微绒毛和伪足减少或消失,部分细胞可见团块脱落形成凋亡小体.当昆明山海棠体积分数为2%时,各组细胞均有不同程度抑制,显示昆明山海棠有细胞毒性,对类风湿关节炎滑膜CD68~-、CD68~+细胞的抑制效应和诱导细胞效应强于同种正常滑膜细胞(P<0.01).在药物体积分数为1%时,对类风湿关节炎滑膜细胞有明显抑制效应(P<0.01).昆明山海棠对诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡作用有明显时间依赖性和剂量依赖性,且凋亡率与相同条件下的抑制率表现出较好的直线相关关系(r=0.497,P<0.01).结论:昆明山海棠对于类风湿关节炎滑膜巨噬样细胞和滑膜成纤维样细胞有诱导凋亡和明显抑制异常增殖作用.在一定浓度下,昆明山海棠对于正常滑膜细胞毒性较小且对类风湿关节炎滑膜细胞的有较明显抑制异常增殖和诱导细胞凋亡的效应.     

类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中白藜芦醇的诱导作用及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化

目的 探讨来自植物中的天然活性成分白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中，凋亡执行因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化状态及其参与作用，并分析其浓度与时间作用。方法：实验于2003-05／10在中南大学湘雅二医院中心实验室完成。人类风湿关节炎滑膜组织取自中南大学湘雅二医院骨科2003-05诊治的1例男性50岁患者。①将手术切取的滑膜组织，剔除脂肪及纤维组织后经清洗、剪碎、消化、离心、培养、传代、获得3-5代细胞，电子显微镜观察滑膜细胞生长过程中的形态变化。②将细胞分为3组，对照组(未用药处理的滑膜细胞)；白藜芦醇组(50，100，200，400μmol／L白藜芦醇处理12h的细胞及用200μmol／L白藜芦醇处理4，8，12，18，24h的细胞)；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂+白藜芦醇组(先用1mmol几天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂预处理2h，再用白藜芦醇处理的滑膜细胞)，各组均设3复管。③比色法测定用200μmol/L白藜芦醇处理后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性；不同浓度的白藜芦醇处理12h后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性。④采用Western-blot分析不同浓度白藜芦醇处理24h的类风湿关节炎滑膜细胞，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的裂解。⑤实验设计为分组匹配对照。结果：①滑膜细胞培养过程中形态学改变：组织块贴壁后三四天，周边有少量滑膜细胞游走爬出。细胞呈多边形或长梭形，有两个或多个突起。培养7d左右，细胞数目增多，逐渐融合。得到第1代滑膜细胞。传代2次以上的滑膜细胞性状稳定，细胞形态以成纤维样细胞为主。②用200μmol／L白藜芦醇分别处理类风湿关节炎滑膜细胞4，8，12，18，24h．天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性于4h后明显升高，12h达高峰，持续至24h以上，白藜芦醇组不同处理时间与对照组比较，均显著增高(P&;lt;0．05)。③对照组及用50，100，200，400μmol／L白藜芦醇处理滑膜细胞12h，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性分别为(1．00&;#177;0．07)、(1．80&;#177;0．17)、(1．96&;#177;0．18)、(2．45&;#177;0．17)、(3．25&;#177;0．24)，呈浓度依赖性的升高，白藜芦醇组不同浓度与对照组均显著增高(P&;lt;0．05)。④对照组及用50，100，200，400μmol／L处理培养的类风湿关节炎滑膜细胞24h，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的表达随药物浓度的增加而减少，100μmol/L时开始出现活性裂解片断P11(Mr11000)，400μmol/L时P11增加。结论：①不同浓度的白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞12h和200μmol／L白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性在4h开始升高，12h达高峰后缓慢下降，提示此现象具有浓度和时间的依赖性。②白藜芦醇浓度为400μmol／L时出现天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性裂解片断P11(Mr11000)吸光度积分值高于100μmol／L，证实了在白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3被活化，并发挥了作用。     

四种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响

目的：探讨吲哚美辛、雷公藤多甙、甲氨蝶呤、地塞米松4种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响，为类风湿性关节炎患者临床用药，改善其功能提供依据。方法：实验于2003—05／2004—02在的第一军医大学细胞生物实验室完成。类风湿性关节炎及正常滑膜组织，分别来源于第一军医大学南方医院脊柱骨病科和汕头市第二人民医院外二科因类风湿性关节炎而行全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术的患者和无关节炎病史的创伤性截肢患者，用原酶消化法获得成纤维样滑膜细胞。用第2～4代细胞在接种12h后分别加入上述药物处理24h，在第5和第10天分别用四甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖情况并统计分析。结果：雷公藤、甲氨蝶呤第5天对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑制率分别为(46．14&;#177;4．20)％和(31．52&;#177;2．86)％，第10天分别(47．00&;#177;1．89)％和(46．73&;#177;3．83)％。消炎痛及地塞米松对成纤维样滑膜细胞增殖无明显抑制作用。这种抑制作用对于类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖尤为明显。雷公藤多甙比甲氨蝶呤对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑制作用有更明显的时间依赖性。结论：雷公藤、甲氨蝶呤对于类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖有明显抑制作用，适当延长甲氨蝶呤用药间隔时间对于抑制滑膜组织过度增生及血管翳的形成效果可能相似。     

染料木黄酮不是通过雌激素受体促进成骨细胞增殖

目的：探讨染料木黄酮对成骨细胞活性的影响及其可能机制。为染料木黄酮防治骨质疏松提供理论依据。 方法：实验于2001—05／2003-01在卫生学环境医学研究所完成。无菌条件下用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分步消化乳鼠颅盖骨获得成骨细胞。传代后细胞用于实验。染料木黄酮组分别加入10^5 ～10^-7 mol／L染料木黄酮，对照组以吐温20为对照。分别用噻唑蓝比色法和^3H-胸腺嘧啶掺入法测定成骨细胞增殖和DNA合成。用反转录-聚合酶链式反应和Western blot测定雌激素受体mRNA和蛋白表达。 结果：①成骨细胞培养基中加入（10^-5～10^-6mol／L）染料木黄酮，培养48h和72h后噻唑蓝的吸光度值与对照组相比均明显升高[培养48h，（039&;#177;0．03），（0．45&;#177;0．03）,（0．46&;#177;0．02），（0．19&;#177;0．05）；培养72h：（0．29&;#177;0．04），（032&;#177;0．02），（0．37&;#177;0．02），（0.15&;#177;0．04）]。②染料木黄酮组^3H-胸腺嘧啶掺入量均显著增加[染料木黄酮组为（101．20&;#177;10．06），（844．60&;#177;366．90），（512．20&;#177;197．6）；对照组为（68．67&;#177;10．39）]未发现成骨细胞雌激素受体基因和蛋白表达。 结论：染料木黄酮不是通过促进雌激素受体基因和蛋白的表达来促进成骨细胞增殖。     

蛇床子素对成骨样细胞UMR106增殖和分化的影响

目的：以在某种程度上可反映成骨细胞增殖的成骨样细胞UMR106为靶细胞，考察蛇床子素对其细胞形态、增殖率和分化程度的影响。方法：实验于2003-03／2004—03，在中国人民武装警察部队医学院药物化学教研室药物活性筛选室进行。以大鼠成骨肉瘤细胞系UMR106为靶细胞，以雌二醇1&;#215;10^-8mol／L为阳性对照，同时设空白对照组，蛇床子素干预组分为1&;#215;10^-8mol／L，1&;#215;10^-7mol／L，1&;#215;10^-6mol／L3个浓度组。①调整细胞浓度为4&;#215;10^-7L^-1，接种于12孔培养板上。48h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。②调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于96孔培养板，采用四唑盐法测定各孔的吸光度，计算平均增殖率。③调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于24孔培养板，磷酸对硝基苯基质动力学法测定细胞内外碱性磷酸酶括性。上述实验每组均设8个复孔。结果：①培养基中加入蛇床子素培养48h后，与对照组相比UMR106细胞数量明显增多，核分裂期多见，1&;#215;10^-6mol／L，1&;#215;10^-7mol／L组可见细胞重叠生长，分泌基质堆积明显。②UMRl06细胞经蛇床子素处理48h后，相对于对照组，1&;#215;10^-6mol／L组增殖率为52％，1&;#215;10^-7mol／L组为37％，1&;#215;10^-8mol／L组为16％。3个给药组与对照组相比差异均有显著性（t=37．36，14．94，6．81，P〈0．01）。③UMR106细胞经蛇床子素1&;#215;10^-6mol／L和经雌二醇1&;#215;10^-8mol／L处理24h和48h后。细胞内碱性磷酸酶活性均显著高于对照组[（825．17&;#177;1234），（775．16&;#177;8．67），（715．14&;#177;14．17）μkat／g；（2415．48&;#177;15．84），（2355．47&;#177;5．67），（2285．49&;#177;7．67）μkat／g；t=16．56，10．22；20．89，34．90，P〈0．01]。④UMR106细胞在浓度为1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-7mol／L的蛇床子素及雌二醇10^-8mol／L培养24h后，细胞外碱性磷酸酶活性显著高于对照组[（781．66&;#177;50），（733．15&;#177;15．34），（728．81&;#177;9．84），（652．80&;#177;11．34）μkat／g；t=22．56，11．9，14.32,P〈0．01]。结论：蛇床子素可剂量依赖地促进UMR106细胞的增殖，刺激UMR106细胞的碱性磷酸酶活性，提示其可能具有直接促进成骨细胞增殖、分化的作用。     

葛根总黄酮对实验性哮喘大鼠的预防效应

目的：探讨脾T淋巴细胞亚群在实验性大鼠哮喘模型中的表达，和葛根总黄酮对T淋巴细胞亚群及对实验性哮喘的预防作用。方法：实验于2003—03-01／04—02在解放军总医院实验动物中心完成。用卵蛋白致敏并激发建立了SD大鼠哮喘模型，32只大鼠随机分为4组，每组8只。为正常对照组、卵蛋白激发哮喘发作组、葛根总黄酮灌胃组、葛根总黄酮预防组，每组分别测定动脉血血气作为哮喘严重程度的缺氧评定指标，测定血液中白细胞介素4水平，同时采用流式细胞仪观察脾T细胞亚群的变化。结果：4组32只大鼠均进入结果分析。①各组大鼠血气结果：卵蛋白激发哮喘发作组动脉血氧分压低于正常对照组和葛根总黄酮灌胃组【(4．24&;#177;2.20)．(10.04&;#177;13)，(9.68&;#177;1．35)kPa，P&;lt;0．01】；卵蛋白激发哮喘发作组剩余碱低于正常对照组和葛根总黄酮灌胃组【(1．82&;#177;1．31)，(2．77&;#177;2．18)，(2．67&;#177;2．18)mmol／L，P&;lt;0.01】；卵蛋白激发哮喘发作组血氧饱和度低于正常对照组和葛根总黄酮灌胃组【(51．8&;#177;35．9)，(64．55&;#177;29．87)，(62.51&;#177;40．31)％，P&;lt;0.05】。②各组大鼠脾T淋巴细胞亚群变化：葛根总黄酮预防组CD4^+低于卵蛋白激发哮喘发作组(13．19&;#177;3．33，18.37&;#177;1．98，P&;lt;0．01)，葛根总黄酮预防组CD8^+高于卵蛋白激发哮喘发作组(8．01&;#177;0．42，6．25&;#177;0．63，P&;lt;0．01)，葛根总黄酮预防组CD4^+／CD8^+低于卵蛋白激发哮喘发作组(1．61&;#177;0.35，2．94&;#177;0．32，P&;lt;0．01)。③白细胞介素4：卵蛋白激发哮喘发作组为(85．2&;#177;12．3)ng／L，比正常对照组和葛根总黄酮预防组大鼠显著增高【(3．3&;#177;0．7)。(7．74&;#177;1．0)ng／L，P&;lt;0．01】。结论：脾T淋巴细胞亚群的活化参与哮喘的发病过程，葛根总黄酮可以抑制免疫细胞T淋巴细胞的活化和过表达，可能通过恢复CD4^+／CD8^+比值，加强CD8^+T淋巴细胞对CD4^+T淋巴细胞的抑制作用，抑制嗜酸性粒细胞增生和IgE的合成从而阻断哮喘发病。     

异搏定对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨钙离子通道阻滞剂异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖的作用，为钙离子通道阻滞剂治疗瘢痕过度增生提供依据。方法：实验皮肤标本来源于2002—07／2003—07北京大学第三医院整形外科5例美容手术或植皮手术患者，取冗余全层皮肤组织，患者知情同意。体外培养3～8代的人皮肤正常成纤维细胞，实验分为异搏定组：包括1&;#215;10^-3, 1&;#215;10^-4, 1&;#215;10^-5, 1&;#215;10^-6, 1&;#215;10^-7, 1&;#215;10^-8,1&;#215;10^-9,1&;#215;10^-10mol／L组，分别在细胞培养孔中加入2mL相应浓度异搏定的培养液；氢化可的松组：在细胞培养孔中加入2mL浓度为1&;#215;10^-7mol／L氢化可的松的培养液；对照组：在细胞培养孔中加入2mL体积分数为0．005的新生牛血清的Dulbecco＇s改良的Eade＇s培养基。检测细胞活力采用锥虫蓝染色；细胞增殖状况测定应用^3氚标记的胸腺嘧啶掺入法；观察细胞增殖抑制率[抑制率（1％）=（阴性对照组每分钟脉冲数值-实验组每分钟脉冲数值）／阴性对照每分钟脉冲数值]，取各例样本的平均值。结果：①人皮肤正常成纤维细胞的增殖动力学结果：对照组人皮肤正常成纤维细胞在接种12h开始增殖，24h达到高峰，48h又逐渐降低。②异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的浓度效应：各浓度的异搏定对人皮肤成纤维细胞的增殖均有抑制作用，其中1&;#215;10^-6mol／L异搏定与1&;#215;10^-7mol／L氢化可的松对成纤维细胞增殖的抑制率无显著性差异（t=0．135,P=0．896〉0．05）。③浓度为1&;#215;10^-6mol/异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的时间效应：氢化可的松在24h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6，12,48h时[（60．67&;#177;18．94）％比（-19．69&;#177;21．26）％，（10．89&;#177;11．61）％，（37．03&;#177;12．17）％，q=10．867．6．732，3．197；P〈0．051；异搏定在24h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6，12，48h时[（51．42&;#177;15．30）％比（-16．83&;#177;16．90）％．（1．09&;#177;11．62）％，（17．41&;#177;13．41）％，q=10．566，7．791，5．265，〈0．051；在药物作用48时异搏定对人皮肤正常成纤维细胞的抑制作用低于氢化可的松（t=2．423,P=0．042〈0．05）。结论：不同浓度的异搏定对体外培养人正常皮肤成纤维细胞增殖有抑制作用，异搏定可能通过抑制成纤维细胞的增殖达到治疗瘢痕过度增生的作用。     

冬季野外训练对战士心理和免疫功能的影响

目的：观察冬季野外训练前后战士心理和免疫功能的变化，并探讨两者之间的关系。方法：选择2004-11/2004-12某部步兵参加冬季野外训练战士110名，男性，年龄18～22岁，军龄1-3年，实验时间为10d。采用症状自评量表（共90个项目，分0-4级评分，0分为无；1分为轻度；2分为中度；3分为相当重；4分为严重）进行症状评估；采用艾森克成人个性问卷（包括4个人格维度：神经质、精神质、掩饰分值越高表示性格越倾向该维度；内外向分值越高，表示性格越倾向外向）进行个性评定。并对血清白细胞介素2浓度、自然杀伤细胞及CD4^＋/CD8^＋细胞比率测定并进行相关分析。结果：110名战士完成测试，血样均合格。①受试战士症状自评量表各因子测评结果：冬训后躯体化、强迫、人际关系、抑郁、焦虑、敌对比冬训前明显降低（1.18&;#177;0．23，1.32&;#177;0．55，1.23&;#177;0．41，1.21&;#177;0．42，1.38&;#177;0．32，1.22&;#177;0.33；1．68&;#177;0．35，1．72&;#177;0．42，1．53&;#177;0．38，1．52&;#177;0．43，1．56&;#177;0．39，1．61&;#177;0．46，t=2．77～7．26，P〈0．05）。②艾克森成人个性问卷测评结果：冬训后精神质、神经质比冬训前明显增高（5．41&;#177;2．13，8．17&;#177;3．89；3．35&;#177;1．87，10．13&;#177;3．47，t=2．78，3．56，P〈0．05）。③免疫功能结果比较：冬训后白细胞介素2、CD4^＋/CD8^＋、自然杀伤细胞较冬训前明显降低[（5．35&;#177;7．84，8．58&;#177;5．92）（1．34&;#177;0．14，1.48&;#177;0．21）（36．32&;#177;3．43，43．28&;#177;3．62）％，t=1．97-3．11，P〈0．05]。④不同个性特征的战士血清细胞介素2、CD4^＋/CD8^＋的变化：冬训后较冬训前明显降低[精神质（4．75&;#177;8．74，1.29&;#177;0．11；8．47&;#177;5．67，1．49&;#177;0．21）；神经质（4．68&;#177;8．37，1.30&;#177;0．12；8．13&;#177;6．22，1.47&;#177;0．24），t=2．31，P〈0．05]。结论：冬季野外训练对战士的心理应激反应和免疫功能有不同程度的影响，而且免疫功能的变化与心理状态和个性特征有关。     

类风湿关节炎患者滑膜树突状细胞的分布及变化

背景：树突状细胞(dendritic cell，DC)与免疫激活和免疫耐受关系密切，其与风湿病的研究处于开始阶段。目的：探讨滑膜树突状细胞在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)中的作用。设计：非随机对照的实验研究。地点和对象：45例标本取自在解放军海军总医院行膝关节镜检查或治疗的RA和创伤患者关节滑膜。采集各例病史、体格检查、实验室检查和影像学资料。其中RA组包括RA患者25例；对照组为创伤患者20例，包括半月板损伤和交叉韧带断裂患者。采用免疫组织化学方法观察滑膜中HLA-DR抗原阳性表达细胞、S-100阳性和CD1a阳性的细胞的多少和分布情况。主要观察指标：两组患者滑膜中HLA-DR抗原阳性表达细胞、S-100阳性和CD1a阳性的DC的多少和分布情况。结果：RA滑膜中23例滑膜细胞HLA-DR表达阳性，19例S-100表达阳性，16例CD1a表达阳性，其阳性例数的百分率均高于对照组。RA组患者滑膜中HLA-DR，S-100和CD1a标记阳性细胞数[(27．8&;#177;14．8％)，(6．2&;#177;4．3％)，(3．9&;#177;3．7％)]均明显高于对照组[(9．9&;#177;7．4)％，(2．8&;#177;2．3)％，(1．6&;#177;1．9)％](t=3．016，2．937，P&;lt;0．01；t=2．462，P&;lt;0．05)。结论：RA滑膜中DC和被激活的DC及HLA-DR阳性细胞的存在和增多可能在RA病变局部提呈自身抗原的过程中起重要的作用，是RA自身免疫异常的重要的始发因素。     

骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法及多向分化潜能

目的：建立原代小鼠骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法，了解问充质干细胞的培养特性及其多向分化潜能。 方法：实验于2004-10／2005-10在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。①间充质干细胞的分离：选取SPF级2月龄昆明种小鼠30只，无菌条件下抽取双侧股骨、胫骨骨髓，制成骨髓单细胞悬液，计数有核细胞的密度。②血清浓度对成纤维样集落的影响：调整有核细胞密度为5&;#215;10^8L^-1，分别接种于体积分数为0．02，0．05，0．1，0．15，0．2，0、25的胎牛血清-DMEM培养基中，每种血清浓度各4孔，1mL／孔，24h后换液。随后每72h换液，连续观察2周。③有核细胞密度对成纤维样集落的影响：分别调整有核细胞至10^6L^-1，10^7L^-1，2．5&;#215;10^8L^-1，5&;#215;10^8L^-1，10^9L^-1，分别接种于12孔板中，每种密度4孔，24h后换液。随后每72h换液，连续观察2周，瑞氏吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数。④成骨与成脂肪诱导：调整有核细胞密度在5&;#215;10^8L^-1，接种于预包被鼠尾胶的12孔板中培养。24h换液，去除未贴壁的细胞，以后每48h换液1次，换液后加入成骨诱导液、成脂肪诱导液。观察各血清浓度下细胞生长情况，消化培养板中的成纤维样集落流式细胞仪检测CD34，CD133，CD90，CD105。VonKossa和油红O法染色鉴定间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。 结果：①不同血清浓度对成纤维样集落形成的影响：胎牛血清-DMEM培养液体积分数为0．02，0．05时，细胞可保持成纤维样，但增殖较慢；体积分数为0．15，0．2，0．25时，细胞增殖较快，但细胞易分化；体积分数为0．1时，细胞可基本保持成纤维样，且增殖速度适中。②有核细胞不同接种密度对成纤维样集落形成的影响：有核细胞接种密度为10^6L^-1，10^7L^-1时，每孔成纤维样集落数为0～1个。接种密度高于10^9L^-1时，每孔成纤维样集落之间出现交叉或融合。接种密度分别为2．5&;#215;10^8L^-1，5&;#215;10^8L^-1，10^9L^-1时，10d左右可见典型的成纤维样集落。成纤维样集落个数与所接种有核细胞密度呈正相关。③成纤维样集落中的问充质干细胞表面标记流式检测结果：成纤维样集落中的问充质干细胞呈CD34^-，CD133^-．CD90^＋，CD105^＋，分别各占2．5％，3．1％，67％和78％。④间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况：成脂肪诱导2周后成纤维样集落中（80&;#177;7）％的间充质干细胞出现脂滴，成骨诱导2周后成纤维样集落出现矿物结节。分别以油红0和Von Kossa’s矿化结节特异性染色后，成脂肪诱导中成纤维样集落（85&;#177;6）％的细胞胞浆呈红色，成骨诱导中大多数的成纤维样集落中心位置出现钙结节。 结论：全骨髓接种合适密度的有核细胞可形成典型的成纤维样集落，且成纤维样集落具有成骨、成脂肪等多向分化潜能。     

海洛因依赖者免疫功能变化的研究

目的：研究海洛因依赖者免疫功能的变化及机制。方法：采用APAAP法、^3HTdR掺入法，检测50例海洛因依赖者外周血T细胞亚群、IL－2R^+细胞数和白介素－2（Interleukin-2,IL-2)水平；采用红细胞C3b受体花环（RBC－C3bRR)、红细胞免疫复合物花环（RBC－ICR）、粘附增强因子活性（RFER）及抑制因子活性（RFIR）试验，观察海洛因依赖者红细胞免疫功能的变化。结果：海洛因依赖者外周血T细胞总数（56．6&;#177;3．4）、IL－2R^+细胞数（15．0&;#177;4．2）及血清IL－2水平（33&;#177;7）与对照组比较显著降低（P＜0．01），而CD4^+细胞（40．5&;#177;3．2）和CD4^+/CD8^+比值（1．65&;#177;0．18）与对照组比较显著升高（P＜0．01）。海洛因依赖者RBC－C3bRR（15．3&;#177;2．1）、RFER（71．4&;#177;8．5）与对照组比较明显下降（P＜0．01），而RBC－ICR（4．8&;#177;1．2）、RFIR（28．1&;#177;4．7）与对照组比较显著则明显升高（P＜0．01）。结论：长期吸食海洛因可降低人体免疫功能。     

次声波对成骨样细胞生物学特性的影响

目的：观察100dB条件下不同频率次声波对小鼠成骨样细胞增殖和分泌功能等生物学特性的影响。方法：实验于2003-03／06在解放军第四军医大学放射生物学教研室完成。复苏培养后的细胞随机分为空白对照组、4Hz100dB组、12Hz100dB组、20Hz100dB组。将冻存的细胞株复苏。选择对数生长期的细胞，以1&;#215;10^7L^-1细胞浓度接种在48孔培养板中，共接种4板并确定细胞贴壁。次日起每天上午8时将各组细胞放人次声仓内。4Hz100dB组、12Hz100dB组、20Hz100dB组分别给予相应频率和声压级参数的次声作用，空白对照组在次声仓内无次声输出，30min／d。共5d。5d后进行细胞增殖计数。观察次声波作用后小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达的变化。结果：①不同参数的次声波对小鼠成骨样细胞增殖的影响：小鼠成骨样细胞的形态为不规则的多角形。受次声波作用后形态无明显改变。次声波作用第5天。4Hz100dB组、12Hz100dB组，20Hz100dB组小鼠成骨样细胞密度均明显高于空白对照组【（52．25&;#177;8．52），（50．33&;#177;7．99），（49．82&;#177;7．05），（39．92&;#177;7．38）10^7L^-1，P均〈0．051。②次声波作用后小鼠成骨样细胞骨钙素的表达情况：次声波作用5d后。4Hz100dB组、12Hz100dB组、20Hz100dB组小鼠成骨样细胞骨钙素浓度均明显高于空白对照组『（1．4012&;#177;0．53l9），（0．8775&;#177;0．2589），（2．2575&;#177;0．8307），（0．5925&;#177;0．1725）μg／L；P=0．001，0．023，0．00051。（3）次声波作用后小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶活性的变化：次声波作用5d后．各组的小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶表达均较低，4Hz100dB组、12Hz100dB组、20Hz100dB组与空白对照组的吸光度值基本相似（0．016&;#177;0．008，0.013&;#177;0．005。0．014&;#177;0．005．0．013&;#177;0．005．P=0．92，1．0．0．95）。结论：4．12Hz100dB次声波作用可明显促进细胞增殖，20Hz100dB次声波作用具有显著分泌骨钙素的作用。提示100dB次声波不同频率下可以促进成骨样细胞的体外增殖和分泌功能。     

1型糖尿病与脾脏CD4^＋CD25^＋调节性T细胞及相关基因Foxp3表达的关系

目的：研究链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导糖尿病小鼠发病中CD4^+CD25^+调节性T细胞(regulatory T cell，Tr)及相关基因Foxp3表达的变化，从而探讨CD4^+CD25^+Tr在自身免疫耐受中的作用。方法：实验选用健康昆明小鼠60只，将60只小鼠随机分对照组(n=20)和模型组(n=40)。模型组给与腹腔注射6g／L STZ溶液，60mg／(kg&;#183;d)，连续5d；对照组给予枸橼酸钠缓冲液0．2mL／d腹腔注射，连续5d。流式细胞仪检测脾脏CD4^+和CD4^+CD25^+Tr细胞数量的变化，RT-PCR检测脾小鼠脾脏细胞中CD4^+CD25^+Tr细胞相关基因Foxp3 mRNA的表达。结果：模型组血糖和抗胰岛素抗体水平明显高于对照组(t=0．023，P&;lt;0．05；t=0．018，P&;lt;0．05)；模型组小鼠脾脏CD4^+T细胞数量[(29．69&;#177;4．77)％]明显高于对照组[(19．60&;#177;11．42)％](t=0．014，P&;lt;0．05)，模型组CD4^+CD25^+Tr／CD4^+T比值低于对照组；Foxp3 mRNA水平模型组的表达普遍高于对照组。结论：CD4^+CD25^+Tr细胞的相对降低，引起外周耐受状态的打破：在STZ破坏胰岛细胞，自身抗原存在的同时，导致了自身免疫糖尿病的发生。     

挑筋法诱导佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的实验研究

目的：实验研究挑筋法对佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡影响。方法：将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、挑筋组，每组10只，实验中建立佐剂型关节炎模型，运用TUNEL法检测挑筋法对大鼠滑膜细胞凋亡的影响。结果：致炎后模型组大鼠后踝关节红、肿，大鼠跛行，体质量下降，跖围与体质量分别为(25．48&;#177;2．16)mm，(123．4&;#177;12.8)g，经挑筋疗法治疗后大鼠后踝关节红、肿消失，跖围、体质量分别为(22．15&;#177;1．17)mm，(132．5&;#177;14．2)g，与模型组比较差异有显著性意义(P&;lt;0．001)。运用TUNEL检测各组滑胞细胞凋亡发现挑筋组和药物组出现明显的细胞凋亡，两者凋亡率分别为(43．81&;#177;3．84)％，(51．58&;#177;9．73)％，两者差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，药物组细胞凋亡率高于挑筋组。结论：挑筋法诱导佐剂型关节炎大鼠滑膜细胞凋亡，故可能通过抑制和减少滑膜细胞的过度增生治疗炎性疾病。