Balb/c小鼠口服幽门螺杆菌疫苗rLTB-HspA的免疫应答

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A (rHspA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)融合蛋白 (rLTB HspA)作为口服疫苗的免疫应答效果。方法　采用rLTB HspA口服免疫Balb c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠黏液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果　Balb c小鼠口服rLTB HspA能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论　Balb crLTB HspA可作为预防和治疗Hp感染的候选疫苗之一     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

ctB和ureⅠ双基因融合表达及其免疫特性分析

目的：构建霍乱毒素B亚单位（CtB）和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（UreⅠ）融合的原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,并初步研究融合蛋白Ct B/Ure Ⅰ的表达特性和免疫特性.方法：PCR从pUC18 ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a（＋）/ureⅠ的ureⅠ基因5＇端插入ctB基因,构建ctB和ure Ⅰ双基因原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,转该质粒于E.coli BL-21（DE3）,经酶切和序列分析鉴定工程菌.IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-Pro Analizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠.用Western blot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性.结果：工程菌含完整的ctB和ure Ⅰ基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%.在22℃,1 mmol/L IPTG诱导4 h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%.Western blot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体.结论：成功构建了能表达CtB/Ure Ⅰ蛋白的大肠杆菌表达菌株.对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和Ure Ⅰ的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础.     

ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a( )/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性

目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.     

幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用

目的 检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异,确定重组表达的GroEL蛋白(r-GroEL)抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性.方法 采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列.构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E.coli BL21DE3原核表达系统,采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性,采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GroEL膜定位.采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用.结果 35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99.4％～ 100％.rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％,SDS-PAGE后提纯的rGroEL在凝胶中显示为单一的条带.rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体,同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体(Hp-IgG)或rGroEL-IgG识别并与之结合.GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原.50、100或200 μg rGroEL免疫可分别使50.0％ (6/12)、75.0％ (9/12)和91.7％ (11/12)小鼠免于幽门 螺杆菌SS1株的感染,200 μg rGroEL免疫保护率(91.7％)显著高于50μg rGroEL(50.0％)( P＜0.05).结论 幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原,可作为基因工程疫苗候选抗原.     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用

目的探讨由2种幽门螺杆菌(Hp)抗原组合的双价疫苗在防治Hp感染中的作用以及减毒鼠伤寒沙门菌作为传递Hp抗原的活疫苗载体的可行性.方法PCR技术扩增尿素酶A亚单位(ureA)和过氧化氢酶(katA)基因片段,构建表达UreA/KatA融合蛋白的重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Westernblot分析UreA/KatA的表达情况.将该重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261株中构建重组口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,再用Hp悉尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和细菌定量培养对胃粘膜中Hp的定植及生长情况进行观察.结果SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子质量(Mr)约108×103的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与抗GST抗体发生特异性反应.动物实验结果显示,经UreA/KatA双价疫苗免疫的小鼠能有效防御Hp的感染.结论表达UreA/KatA融合蛋白的双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.     

重组流感病毒H1N1活菌疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

目的获得两种流感病毒重组沙门氏菌X4550(asd-pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-NA)活菌疫苗,并对其免疫效果进行初步的研究。方法将本室已构建好的重组质粒pVAX1-HA及pVAX1-NA双酶切后得到HA、NA基因,将其克隆入asd-pVAX1构建重组的表达质粒。将重组质粒转染COS-7细胞,用免疫细胞化学方法鉴定重组质粒体外的表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,以2×109CFU/只的剂量三次口服免疫Balb/c小鼠。结果asd-pVAX1-HA和asd-pVAX1-NA均能在COS-7细胞中表达;免疫小鼠不仅可以检测到HA、NA特异性的血清IgG及IgA抗体;刺激黏膜免疫反应,产生sIgA抗体,而且能抵抗40LD50同型病毒滴鼻的攻击。结论H1N1流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌运送系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18 免疫优势表位的预测与鉴定

目的:分析预测幽门螺杆菌(Hp)外膜蛋白Omp18 的免疫优势表位,并进一步验证确定其免疫优势片段的免疫原性。方法:通过生物信息学软件DNAStar 分析预测幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18 的潜在优势表位,并由北京赛百盛基因技术有限公司合成相应的优势片段;片段通过口服免疫的方式免疫接种雌性BALB/ c 小鼠,每周1 次共免疫4 次。末次免疫10 d后处死小鼠,取血清检测IgG、IgA 水平,取肠道灌洗液检测sIgA 水平;取小鼠脾细胞ELISA 法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6 水平,并通过MTT 比色法检测脾细胞增殖情况;末次免疫10 d 后Hp 标准株攻击小鼠2 次,4 周后处死小鼠,取胃组织进行快速尿素酶实验,并计算每组的感染率。结果:ELISA 法检测各片段免疫小鼠血清IgG、IgA 以及肠道sIgA 水平均高于对照组,且差异有显著统计学意义(P<0.05);各免疫组脾细胞上清INF-γ、IL-2 水平均显著高于对照组(P<0.05),而IL-4、IL-6水平较对照组则差异无显著统计学意义(P>0.05);MTT 比色法结果显示各片段刺激后小鼠淋巴细胞均有显著增殖(P<0.05);快速尿素酶实验结果提示各片段免疫后均能显著减少小鼠胃组织中Hp 的感染(P<0.05)。结论:通过生物信息学软件分析预测的外膜蛋白Omp18 优势片段均具有较好的免疫原性,且对Hp 感染有一定的保护作用。     

Oral immunization with recombinant Streptococcus lactis carrying the Streptococcus mutans surface protein antigen gene.

A recombinant Streptococcus lactis strain which carries the structural gene for a surface protein antigen (PAc) of 190,000 daltons from Streptococcus mutans serotype c was constructed for development of an oral vaccine against dental caries. The gene from S. mutans MT8148 joined to shuttle vector pSA3 was successfully transformed into S. lactis IL1403. A small amount of PAc was detected in the cell homogenate and cytoplasmic fraction of the recombinant S. lactis, but not in the culture supernatant of the recombinant, by Western immunoblotting and dot immunoblotting. The level of PAc-specific mRNA in the recombinant strain was lower than that in S. mutans MT8148. However, significant salivary immunoglobulin A and serum immunoglobulin G responses to PAc were induced in mice immunized orally with the recombinant S. lactis.     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

结核杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及其DNA免疫实验

目的：构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65kD基因为基础的核酸疫苗。方法：采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果：重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体，能抵抗结核杆菌的感染。结论：以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功，并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治的作用奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2。经限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliXL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测。结果构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力。结论成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础。     

Intranasal coadministration of live lactococci producing interleukin-12 and a major cow's milk allergen inhibits allergic reaction in mice

The Th1/Th2 balance deregulation toward a Th2 immune response plays a central role in allergy. We previously demonstrated that administration of recombinant Lactococcus lactis strains expressing bovine beta-lactoglobulin (BLG), a major cow's milk allergen, partially prevents mice from sensitization. In the present study, we aimed to improve this preventive effect by coadministration of L. lactis BLG and a second recombinant L. lactis strain producing biologically active interleukin-12 (IL-12). This L. lactis strain producing IL-12 was previously used to enhance the Th1 immune response in a tumoral murine model (L. G. Bermúdez-Humarán et al., J. Immunol. 175:7297-7302, 2005). A comparison of the administration of either BLG alone or BLG in the presence of IL-12 was conducted. A BLG-specific primary Th1 immune response was observed only after intranasal coadministration of both L. lactis BLG and IL-12-producing L. lactis, as demonstrated by the induction of serum-specific immunoglobulin G2a (IgG2a) concomitant with gamma interferon secretion by splenocytes, confirming the adjuvanticity of IL-12-producing L. lactis. Immunized mice were further sensitized by intraperitoneal administration of purified BLG, and the allergic reaction was elicited by intranasal challenge with purified BLG. Mice pretreated with BLG in either the presence or the absence of IL-12 were rendered completely tolerant to further allergic sensitization and elicitation. Pretreatment with either L. lactis BLG or L. lactis BLG and IL-12-producing L. lactis induces specific anti-BLG IgG2a production in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. Although specific serum IgE was not affected by these pretreatments, the levels of eosinophilia and IL-5 secretion in BAL fluid were significantly reduced after BLG challenge in the groups pretreated with L. lactis BLG and L. lactis BLG-IL-12-producing L. lactis, demonstrating a decreased allergic reaction. Our data demonstrate for the first time (i) the induction of a protective Th1 response by the association of L. lactis BLG and IL-12-producing L. lactis which inhibits the elicitation of the allergic reaction to BLG in mice and (ii) the efficiency of intranasal administration of BLG for the induction of tolerance.     

EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

目的：构建EB病毒基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以B95—8细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）培养上清为模板，用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，插入原核表达载体pGEX-5T中，构建pGEX5T-85N重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Westernblot鉴定，并免疫BALB／c小鼠。结果：序列分析表明，插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000，同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经ELISA检测获得了高效价的抗血清，且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Westernblot显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论：表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。