HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的 构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系（LCLs）。方法 用定点突变技术将HBVp3．8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变（p3．8Ⅱ-V60,G87,L97）,转化E．coli．XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶Sac I和Kpn I分别将野生型和突变型p3．8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论 DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)全基因组C区L97和V60突变质粒,并检测其生物学活性。方法采用定点突变技术将HBVadr1.2拷贝基因组质粒p3.8Ⅱ进行C区点突变,构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞,Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制,ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果测序结果表明所构建的突变质粒p3.8L97和p3.8V60分别为nt2189A→C和nt2086C→G,突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论所构建HBV(adr型)全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因组C区L97和V60突变质粒，并检测其生物学活性。方法 采用定点突变技术将HBVadr1．2拷贝基因组质粒p3．8Ⅱ进行C区点突变，构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞，Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制，ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果 测序结果表明所构建的突变质粒p3．8L97和p3．8V60分别为nt2189A→C和nt2086→G，突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论 所构建HBV（adr型）全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

PS1基因突变转染细胞中α-分泌酶活性的实验研究

目的通过观察两种细胞系3个不同位点早老素基因1(PS1)突变转染细胞中α-分泌酶活性的变化,探讨PS1基因突变对α-分泌酶活性的影响,及两者在家族性阿尔茨海默病病理机制中可能存在的联系。方法利用荧光酶标反应法和Western blot免疫印迹方法分别检测突变型PS1M146L和野生型APP_(751)双转染稳定表达CHO细胞系,及突变型PS1V97L、PS1A136G单转染稳定表达SH-SY5Y细胞系,3种类型的PS1突变细胞α-分泌酶活性及其作用产物分泌型α淀粉样蛋白(sAPPα)表达。结果PS1M146L/APP_(751),双转染CHO细胞系与野生型PS1/APP_(751)双转染CHO细胞系相比α-分泌酶活性有降低,统计学检验差异显著(P＜<0．05)。PS1V97L和PS1A136G突变单转染稳定表达SH-SY5Y细胞系较野生型PS1组均有降低,其中PS1V97L与野生型PS1组α-分泌酶活性比较有显著性差异(P＜0．05),PS1A136G组较野生型PS1组有降低,但无统计学意义。Western blot方法检测α-分泌酶活性作用产物可溶性α淀粉样蛋白结果显示,未转染CHO、SH- SY5Y细胞系与其对应的转染野生型PS1基因的细胞系sAPPα蛋白表达量基本相同,突变型PS1V97L和PS1A136G单转染SH-SY5Y细胞系较野生型PS1组蛋白表达量少,突变型PS1M146L/ APP双转染CHO细胞系中sAPPα蛋白表达量也少于野生型PS1 M146L/APP双转染CHO细胞系。结论PS1基因突变促使α-分泌酶活性降低可能是PS1基因突变导致家族性阿尔茨海默病病理机制之一,PS1致病性与α-分泌酶活性的降低程度可能存在正相关,PS1M146L/APP双转染CHO细胞系与PS1V97L单转染细胞系均可适用于作为探讨家族性阿尔茨海默病中PS1突变与α-分泌酶功能关系研究的细胞模型。     

Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

人H-Ras12V突变蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建研究H-Ras12V突变蛋白的表达载体,并在体外进行表达和检测.方法:从细胞中分离提取RNA,通过RT-PCR扩增获得人的正常H-RascDNA,测序鉴定.通过PCR介导的定向突变的方法,在其第12位氨基酸处引入一个错义突变G→V,连入测序载体进行鉴定.应用DNA重组技术,将获得的H-Ras12VcDNA插入真核表达载体pEGFP-C2,使用限制性酶切反应鉴定.通过脂质体将重组质粒转染入Hela细胞,使用Western Blot对其融合蛋白进行检测.结果:经过XhoI和BamHI的双酶切以及测序鉴定证实成功构建了pEGFP-H-Ras12V融合蛋白表达载体,克隆基因与GenBank登陆结果一致并成功实现其第12位氨基酸G→V的突变.WesternBlot证实融合蛋白特异性表达,并在转染的细胞系中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:成功构建了pEG-FP-H-Ras12V融合蛋白的表达载体,并在体外鉴定EGFP-H-Ras12V融合蛋白的表达.     

稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系.真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测.结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达.结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系.     

稳定表达外源性p53基因U14细胞系的建立及鉴定

目的建立稳定表达外源性p53基因的U14细胞系。方法将提取的含p53质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U14细胞，经含G418选择培养基筛选得到稳定转染的细胞系．用间接免疫细胞化学法鉴定外源性p53基因的表达情况。结果筛选得到的U14细胞系可检测到外源性p53蛋白的表达。结论建立了稳定表达外源性p53基因的U14细胞系，为进一步研究p53基因用于肿瘤免疫治疗奠定基础。     

稳定表达乙型肝炎病毒含前S2的表面抗原重组细胞系的建立

目的 建立稳定表达含有pre-S2的HBsAg的细胞系。方法 构建在真核细胞表达pre-S2-HB-sAg的重组质粒PCI-HBs2。用此质粒转染HepG2细胞，经克隆化培养以及G418筛选，建立稳定表达HBsAg的细胞系。对其分泌动态、细胞纯度、遗传稳定性等生物学特性做了鉴定。同时对该细胞实验室大量培养的条件进行了优化。结果 成功构建表达pre-S2-HBsAg的重组质粒。转染细胞后筛选到一个稳定表达pre-S2-HBsAg的细胞系3E3。ELISA检测表明该细胞系分泌的HBsAg水平高，生物学性状研究结果表明稳定表达HBsAg的3E3细胞纯度好，遗传性状稳定。结论 成功建立了稳定表达pre-S2-HBsAg的细胞系。该细胞系遗传性质稳定，表达蛋白产量高。此细胞系可用于pre-S2-HBsAg的制备及纯化。     

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的 建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料.方法 运用脂质体介导的基因转染法将pSV3 neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆并扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合,RT-PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线.结果 阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代,经鉴定SV40T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达.结论 成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系.     

HBcAg检出与其他HBV标志的关系

本文采用固相放免法对94例慢性HBV无症状感染者血清作HBcAg检出并比较其它HBV标志物的关系。结果表明:血清HBcAg能直接反映HBV存在,其检测可作为人体内是否存在Dane颗粒及其复制程度标志,是反映HBV传染性的可靠指标。     

医学生减量接种乙肝疫苗近期的效果

作者对HBV血清学标记均阴性的193名医学生分别肌肉注射25,5,10μg乙肝疫苗,按0,1,6月方案接种,并随访观察1年.注射3次乙肝疫苗后,3个剂量组的抗-HBs应答率均在90％以上,在首次注射后1,4,7,12月时,无论是抗-HBs应答率或抗-HBs S/N均值在3个剂量组之间均无显著差别。本观察近期结果提示,在医学生中接种2.5μg剂量疫苗代替常规的10μg疫苗,可以节省资金,扩大接种人数,缓和乙肝疫苗供应紧张状况。     

HBsAg和抗—HBs同时阳性患者的传染性及随访

在1660份HBsAg阳性血清中,112份血清检出抗-HBs(6.75％),HBsAg与抗-HBs同时阳性的血清中,49.1％HBeAg阳性,46％HBV-DNA阳性,提示此种血清近半数具有传染性。对36例HBsAg与抗-HBs同时阳性的慢性HBV感染者进行为期2～30月的随访观察,72％病例抗-HBs仅短暂出现,无一例HBsAg转阴,表明慢性HBV感染患者出现此血清学模式并非预示HBV行将消除。     

HBsAg消失后的转归和免疫干预接种效果

目的观察HBsAg消失后的转归及对乙肝疫苗和乙肝疫苗加免疫激动剂干预免疫的效果。方法连续收集感染HBV后HBsAg消失，以后未出现抗-HBs者97名，年龄18～68（41．9）a，分三组。1组57（22名来自组2对乙肝疫苗无反应者）名，予CHO乙肝疫苗30gg，三角肌内注射，1次／wk，共4针；于同侧近腋皮下注射胸腺因子α1（Tα1）1．6mg，2次／wk，共4wk。2组35名，只接种乙肝疫苗，剂量、方法同1组。3组27名，仅作定期复查。结果末针后1mo五项均阴性、抗-HBe＋和抗-HBc＋、抗-HBc＋者中抗-HBs阳转者组1为12／16（75．0％）、14／19（73．1％）、14／22（63．0％）名，组2仅五项全阴性者中1名（1／10，10．0％），组3无1名，差异显著（P〈0．01）。来自组2的22名抗-HBs阳转率（59．1％）亦高于组2和3（P〈0．01）。随访4．7（2-6）a组1和3抗-HBc消失各1名，平均年消失率为0.3％。平均抗-HBs年阳转率为1．4％。组2、3各有1名出现HBsAg复阳（2．4％）。结论HBsAg消失后年抗-HBs自发性阳转率和抗-HBc消失率很低，甚至有逆转为HBsAg的可能；较大剂量乙肝疫苗加Tα1干预免疫是一有效的方法，对HBV血清学标志物全阴者效果尤佳。     

第0、7、14天程序接种乙肝疫苗对50岁以上人群的免疫效果

目的观察快速乙肝疫苗接种方案对50a以上人群乙肝免疫的效果。方法健康受试者分两组，组137名，年龄59．3（51—71）a，组2（对照组）41名，年龄58．6（51—69）a。组1按d0、7、14程序，组2按mo 0、1、6程序三角肌内接种20gg乙肝疫苗。于首针接种后1、3、7、12、24和36mo分别检测HBsAb滴度等。结果组1（100％）全程接种完成率显著高于组2（31／41，75．0％）（P〈0．05）。首针接种后1、3mo组1HBsAb阳转率（78_4％和81．1％）显著高于组2（4．8％和17．1％）（P〈0．01），12—36mo各时段者两组接近（P〉0．05）；组1HBsAb有效保护率（75．7％、78.4％）显著高于组2（0％和9．8％）（P〈0．01）；组1血清HBsAb几何平均滴度（GMT）（76．5IU／L和80．6IU／L）显著高于组2（2．6IU／L和30．5IU／LXP〈0．01）。对标准方案无反应者改用d0、7、14方案接种后HBsAb阳转率（66．7％）明显提高（P〈0．05）。结论d0、7、14方案接种方便；全程接种完成率高；HBsAb阳转和GMT峰值出现早；对中老年人群总体效果较标准方案为优。     

血清前－S_2蛋白检测的临床意义

采用ＥＬＩＳＡ法检测１０４例各类型乙型肝炎（乙肝）患者的血清前－Ｓ２抗原（Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ）及其抗体（Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ），结果表明，Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｇ的出现与ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ呈显著相关性（Ｐ值均＜０．００５），主要见于乙肝急性期及慢性乙肝患者，说明病毒复制活跃、传染性强。而Ｐｒｅ－Ｓ２Ａｂ阳性仅见于急性乙肝恢复期。     

快程序接种改善HBV阳性母亲子女的免疫效果

目的研究快速乙肝疫苗接种方案对HBV标志阳性母亲子女的免疫效果。方法健康受试者分3组,组1、3为HBV标志阳性母亲的子女,组2为正常母亲子女．组159名,年龄1h-12（5．3）a。组254名,年龄1h-13（4．8）a。组3（对照组）62名,年龄1h-13（5．5）a。组1和组2按快程序（d0、7、14）、组3按标准程序（mo 0、1、6）三角肌内接种10μgCHO乙肝疫苗。于首针接种后1、3、7、12、24和36mo分别查HBsAb滴度等。结果全程接种完成率三组（100％、100％和91．9％）接近（P〉0．05）。首针接种后1、3mo组1（81-3％、83．1％）和组2（96.3％、96.3％）HBsAb阳转率显著高于组3（3．2％、22．6％）（P〈0．01）,组2明显高于组1和组3（P〈0．01）;7—36mo各时段者组1和组3接近（P〉0．05）,均明显低于组2（P〈0．01）。血清HBsAb保护率3组间差异与HBsAb阳转率类似。首针接种后1、3moHBsAb几何平均滴度（GMT）组1（84．3IU／L、84．5IU／L）和组2（138．4IU／L、143．6IU／L）显著高于组3（2．7IU／L、28．2IU／L）（P〈0．01）,7-36mo各时段者组1和组3接近（P〉0．05）,均明显低于组2（P〈0．01）。3组中父亲为HB病人／HBsAg／HBV携带者的19名中6名无反应,8名弱反应,5名反应;父亲为HBsAb阳性者均有反应。结论快程序接种方便;HBsAb阳转率高,GMT峰值出现早;为儿童乙肝免疫理想方案．     

泰安市青年人群乙型肝炎血清标志物检测分析

目的探讨本市青年人群中乙型肝炎病毒（HBV）的感染情况和乙型肝炎五项血清标志物的模式特征.方法用酶联免疫吸附试验 （ELISA） 测定部分青年血清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）及其抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）及其抗体（HBeAb）以及核心抗体（HBcAb ）五项HBV血清标志物（HBVM）.结果 4593例中2673例为全阴性,占总数58.20%;1920例为HBVM五项中有一项或一项以上阳性,总阳性率为41.80%,模式共有14种,分为感染期模式组和恢复期模式组,感染期模式组以“135”和“145”模式为主;恢复期模式组以“25”和“2”模式为主.结论在泰安市青年健康人群中,乙肝的总感染率仍较高,应加强乙型肝炎的防治和乙肝病毒的检测.     

1960份血清HBV标志物检测结果及分析

目的：调查ＨＢＶ在不同性别、年龄、职业中感染情况及疫苗效果。方法：用ＥＬＩＳＡ法对某矿１９６０份血清进行五项ＨＢＶＭ检测。结果：ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶＭ、抗－ＨＢｓ，疫苗接种后抗－ＨＢＳ阳性率分别为１１．４３％，１７．３９％，８．６８％，２９．９８％。ＨＢＶＭ阳性率与性别、年龄、职业无关。上述抗－ＨＢｓ阳性率均与性别无关，而在年龄、职业组内存在明显差异（Ｐ＜０．０５）。结论：该区为乙肝高发病区；抗－ＨＢｓ产生与年龄大小呈负相关；从事饮食业人员中抗－ＨＢｓ阳性率低，疫苗接种效果不显著。     

某医科大学学生中病毒性甲型与乙型肝炎的前瞻性研究

作者调查了某医科大学712名新生的甲、乙型肝炎感染情况。发现:抗-HAV阳性533人,占74.86％,HBsAg阳性13人,占1.83％,抗-HBc阳性113人,占15.87％,抗-HBs阳性207人,占29.07％。抗-HBs的S/N值(标本与阴性对照比值)>50者44人,占6.18％,HBV感染率为为35.39％。对251人追踪1年的观察中,无一人感染乙肝,有4人感染甲肝,均为隐性感染。建议在招生时严格把好HBsAg筛检关,尽量减少HBsAg漏检,并对无乙肝保护力的学生给予乙肝疫苗接种,预防乙肝感染。