壳聚糖导管桥接周围神经缺损的实验研究

目的　应用壳聚糖神经导引管作为神经再生室桥接大鼠坐骨神经缺损 ,观察对神经再生的作用。方法　选用体重 2 0 0± 2 0g的Wistar大鼠 30只 ,手术造成右侧坐骨神经长约 12mm的缺损 ,以壳聚糖导管桥接神经缺损 ,以左侧正常坐骨神经作为对照 ,分别于术后 4、 12、 2 4周进行大体及显微解剖观察、组织学检查、免疫组化检查、电镜观察和神经电生理测定。结果　术后大鼠右后肢感觉、运动功能有不同程度的恢复 ;光镜和电镜组织学检查发现术后 12周再生轴突已长过神经缺损间隙 ,2 4周再生完全 ,髓鞘化良好 ,神经纤维排列整齐规则 ,导管大部分被降解吸收 ;神经电生理检查在术后 2 4周记录到再生坐骨神经的复合动作电位。结论　壳聚糖神经导引管为大鼠坐骨神经再生提供一个良好的再生微环境 ,再生坐骨神经功能恢复良好     

PDLLA／NGF复合导管促进周围神经缺损再生的形态学研究

目的探究聚d,L-乳酸,神经生长因子(PDLLA/NGF)可吸收性复合导管桥接对大鼠坐骨神经缺损再生修复的促进作用,为临床上周围神经损伤再生修复提供实验依据。方法60只SD大鼠随机均分4组:自体神经移植(A组),单纯PDLLA导管(B组),PDLLA加一次性给NGF(C组),复合导管(D组)。制作坐骨神经10 mm缺损,按上述分组桥接,手术后1、2、3月每组各取5只修复处组织。行大体观察、三头肌湿重、光镜观察与图像处理、电镜超微结构观察。结果同时间段组间比较,三头肌恢复率A组高,D组次之,C组较差,B组最差(P<0.05)。组织学观察及图像分析显示,D组再生神经的数、质量都显著优于B、C组(P<0.05),接近A组。电镜观察显示A、D组中段神经纤维密度大、直径大、髓鞘厚,内有发育良好的神经丝和微管。B、C组神经稀、直径小、髓鞘薄、无髓神经相对多。结论PDLLA/NGF复合导管具有良好的组织相容性。用该管桥接修复大鼠受损的坐骨神经,能有效地促进其再生。     

联合应用甲壳素导管与IGF-1对大鼠坐骨神经再生的研究

本实验探讨联合应用甲壳素导管与IGF-1对大鼠坐骨神经再生功能的影响,为治疗周围神经损伤提供科学依据。1实验方法健康雄性SD大鼠48只,随机分为3组,每组16只,制备双侧大鼠坐骨神经缺损模型(神经缺损10mm),以可吸收甲壳素神经导管桥接神经两断端形成神经再生室。A组为空白对照组:神经再生室内注入等渗生理盐水20μL;B组为对照组:神经再生室内注入明胶溶液20μL;C组为实验组:神经再生室内注入IGF-1凝胶20μL。术后4周、8周收集标本并观察再生神经的大体形态,检测神经传导速度,并进行特殊染色,S-100免疫组化检测,使用统计软件SPSS 17.0进行统计学分析。     

1102/异种神经脱细胞移植物桥接大鼠坐骨神经缺损

目的　探讨异种神经脱细胞移植物桥接大鼠坐骨神经缺损后的神经再生及其再生过程中免疫排斥反应。 方法　用脱细胞兔周围神经作为移植物桥接大鼠坐骨神经1cm缺损;术后3、5、8、11、15天检测血液中淋巴细胞占白细胞百分比;3个月后取移植物及腓肠肌,用甲苯胺蓝、乙酰胆碱酯酶(AchE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)组化染色,光、电镜观察神经再生及腓肠肌运动终板的恢复情况。　 结果　术后大鼠血液中淋巴细胞占白细胞的百分比与正常大鼠相比较无显著性差异,3个月后大鼠术侧下肢足趾能分开,行走时后蹬动作有力,针刺足底有逃避反应,桥接物内见有大量再生的坐骨神经纤维,腓肠肌肌纤维上见有呈AchE阳性的运动终板和神经纤维。　 结论　异种神经脱细胞移植物桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其再生的作用。     

聚乳酸聚羟基乙酸共聚物三维神经导管修复周围神经缺损

背景：异体神经移植由于存在难以消除的宿主免疫排斥反应,限制了其使用,许多学者试图用其他组织替代来弥补以上不足,但效果均不满意。目前,尚没有研制出公认的效果满意的人工神经,自体神经移植至今仍被认为是最佳选择。 目的：观察聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA,85∶15)三维神经导管修复大鼠周围神经缺损的可行性,及神经导管内微丝支架的作用和不同数量微丝对神经再生的影响。 方法：40只成年SD大鼠随机数字表法分为4组,制作大鼠12 mm的左侧坐骨神经缺损模型,用该导管桥接大鼠12 mm的坐骨神经缺损。A组：PLGA神经导管组;B组：PLGA神经导管内纵形放入20根PLGA微丝;C组：PLGA神经导管内纵形放入40根PLGA微丝;D组：自体神经移植组。A、B、C组神经导管内均注入层粘蛋白+神经生长因子混合液。造模后动态观察大鼠肌肉萎缩、跛行情况,测量神经导管内再生神经的传导速度、小腿三头肌湿质量恢复率。对再生神经中1/3段行组织学观察及图像分析以评价神经修复的效果。 结果与结论：造模后各组再生神经均已通过神经导管长入远端,B、D组再生神经较A、C组粗大;再生神经的运动神经传导速度B组和D组明显快于A组和C组(P < 0.05);A组、C组肌肉萎缩最明显,而B组、D组肌肉萎缩较轻且肌肉萎缩程度基本相当。病理图像分析神经纤维计数以D组最多,B组次之,而与A组、C组相比差异均有显著性意义(P < 0.05),B组与D组的再生神经纤维数量及成熟程度均要明显优于A组和C组。提示新型的PLGA三维神经导管能有效引导SD大鼠坐骨神经长过12 mm的神经缺损,是一种较理想的神经导管;神经导管内微丝支架能有效引导神经再生,数量过多反而可能抑制神经再生。     

4001/生物管自体神经串联修复神经缺损的动物研究

目的：探讨利用壳聚糖管（Chitosan tube）加自体神经片断修复大鼠坐骨神经长段神经缺损的可行性和优越性，比较（A组）壳聚糖管自体神经片断串联、（B组）壳聚糖管内包裹自体神经片断、与（C组）单一壳聚糖管三种方式促神经生长得优劣，寻找一种简单、有效的修复长段神经缺损的方法。结果：A、B、C三组、术后4个月检测坐骨神经动作电位传导速度分（20.91±2.05）m/s （ 15.40±2.25）m/s（14.09±1.99）m/s；有髓神经纤维数目（311.79 ±3.78）（240.92 ±8.06）（232.90 ±5.17）。以上指标A组均高于B C组，比较有显著性差异（ P<0.01）。结论 A组与B C组比较 可以明显提高神经修复的效果。本实验中可修复 大鼠坐骨神经12mm的缺损。     

应用肌膜瓣包裹、羊膜管预置聚乳酸-羟基乙酸微丝模拟周围神经再生

背景：周围神经损伤部位的微环境状况是影响神经再生的重要因素之一。周围神经损伤后，良好的神经再生微环境有利于保护受损神经元、促进轴突的有效再生。 目的：应用肌膜瓣包裹、羊膜管预置聚乳酸-羟基乙酸微丝，充填大鼠自体周围神经组织浆模拟周围神经再生微环境，探讨其修复坐骨神经缺损的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-06/2007-10在广东医学院实验动物中心完成。 材料：清洁级2月龄SD大鼠30只，随机分为实验组、对照组、标准组3组，每组10只，右侧为实验侧，左侧为正常对照侧。取健康、足月、顺产的新鲜胎儿羊膜(产妇知情同意) 制备羊膜基质膜。用医用Vicryl缝线和羊膜基质膜制备聚乳酸-羟基乙酸微丝桥接物。 方法：大鼠切除坐骨神经6.0 mm，自然回缩建立坐骨神经缺损模型。实验组采用带蒂肌膜瓣、人羊膜管预置Vicryl微丝并充填大鼠自体坐骨神经组织浆；对照组采用单纯人羊膜管充填大鼠自体坐骨神经组织浆；标准组采用自体神经移植，桥接大鼠坐骨神经缺损。 主要观察指标：术后8，12周行大体观察、组织学检查、胫前肌湿质量、有髓神经纤维通过率及神经电生理学检测。 结果：术后12周，实验组、标准组肌萎缩有所恢复，对照组则恢复不明显。实验、标准组患侧胫前肌色泽红润，饱满富有弹性；对照组色泽相对较暗，弹性度较差。术后8，12周3组胫前肌恢复率组间比较，术后12周3组有髓神经纤维总数、截面积，神经移植体血管数和血管截面积组间比较，以及小腿三头肌复合肌动作电位幅值组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05），其中标准组神经纤维再生质量最佳，实验组优于对照组。 结论：肌膜转位、羊膜管预置聚乳酸-羟基乙酸微丝，并填充大鼠自体周围神经组织浆导管能较好的模拟周围神经再生之微环境，促进神经纤维再生，但与自体神经移植尚有差距。     

无细胞神经支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损*☆

背景：作者已经成功制备了无细胞神经移植物,并且复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。 目的：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损后运动功能的恢复。 方法：成年雄性SD大鼠构建大鼠坐骨神经15 mm缺损模型,分别应用组织工程人工神经、组织工程神经支架或自行神经桥接坐骨神经缺损。桥接后20周再生神经电生理学测定,手术侧胫骨前肌湿质量、腓肠肌组织学及透视电镜分析。 结果与结论：桥接20周后,组织工程人工神经与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比较,差异无显著性意义(P > 0.05),神经干传导速度为(30.56±2.15)m/s。结果提示,无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损后,可以促进再生神经运动功能的恢复。     

HRP逆行示踪评价复合骨髓间充质干细胞的无细胞神经移植物

背景：作者前期将无细胞神经移植物与骨髓间充质干细胞复合培养,成功构建了组织工程人工神经。 目的：应用辣根过氧化物酶(HRP)神经逆行示踪技术对无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的神经移植复合体桥接大鼠坐骨神经缺损后运动神经元的保护作用进行评价。 方法：成年清洁级健康雄性SD大鼠,随机分成3组：①实验组：采用复合骨髓间充质干细胞的无细胞神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损。②空白对照组：采用无细胞神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损。③自体神经对照组：采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损。术后12周应用辣根过氧化物酶神经逆行示踪技术对脊髓前角运动神经元的再生进行评价。 结果与结论：术后12周脊髓前角运动神经元再生评价结果显示：实验组优于无细胞神经移植物组,而与自体神经移植物组相比差异无显著性意义。证实无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损,对大鼠脊髓运动神经元具有保护作用,可能达到与自体神经移植相似的效果。 关键词：无细胞神经移植物;骨髓间充质干细胞;辣根过氧化物酶;神经移植;大鼠     

外源性神经生长因子诱导下自体静脉桥接修复神经缺损

背景：采用自体神经游离移植修复神经缺损效果比较理想,但有其弊端。为此寻求一种更佳修复神经缺损的治疗方法。 目的：验证及外源性神经生长因子诱导下自体静脉桥接神经缺损对神经再生的影响。 方法：采用Wistar大鼠建立周围神经缺损模型。随机将大鼠分为3组。实验组采用自体静脉桥接并注入神经生长因子;对照组采用自体静脉桥接并注入生理盐水;标准组采用自体神经桥接。分别于术后1,3个月,对实验动物进行活体观察,电生理检测及组织学检测。 结果与结论：3组实验动物均有神经再生及修复表现,但程度不同。实验组失神经表现恢复的较对照组早,电生理检测运动神经传导速度快,组织学检查再生神经纤维数量及质量明显高于对照组(P < 0.05);与“金标准”的自体神经桥接组比较无显著性意义(P > 0.05)。结果提示采用自体静脉桥接+神经生长因子诱导对周围神经缺损后的再生、修复具有有促进作用,可以使再生神经纤维的数量增加并显著提高再生神经纤维质量。     

组织工程周围神经修复坐骨神经缺损应用研究

目的应用组织工程方法构建周围神经以修复坐骨神经缺损.方法体外培养的雪旺细胞(SC)与牛去细胞基质(BAM)、胎牛血清和培养液按一定的比例混合注入聚乳酸聚羟基己酸共聚物(PLGA)导管中,构建成组织工程周围神经.30只SD大鼠随机分为3组,实验组:使用组织工程周围神经修复坐骨神经缺损;对照组:用不含雪旺细胞的导管修复;自体神经组:自体神经移植.16周后通过免疫组化、电生理、透射电镜、辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪及坐骨神经功能指数(SFI)等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况.结果 PLGA导管至16周已基本吸收,再生神经已通过缺损区长至远端,组织工程周围神经的修复效果接近自体神经组,优于空白组.结论体外构建的组织工程周围神经可以修复周围神经缺损.     

Chitosan tube bridging autologous nerve segments for the repair of long-segmental sciatic nerve defects

BACKGROUND:Previous tissue-engineered nerve studies have focused on artificial nerve and nerve cell cultures.The effects of regeneration chambers with autologous nerve bridging for the repair of nerve defects remain unclear.OBJECTIVE:To explore the feasibility and advantages of chitosan tube bridging autologous nerve segments for repairing 12-mm sciatic nerve defects in rats.DESIGN,TIME AND SETTING:A randomized,controlled,animal study using nerve tissue engineering was performed at the Animal Laboratory and Laboratory of Histology and Embryology,Liaoning Medical University from June 2008 to March 2009.MATERIALS:Chitosan powder was purchased from Jinan Haidebei Marine Bioengineering,China.METHODS:A sciatic nerve segment of approximately 8 mm was excised from the posterior margin of the piriformis muscle of Sprague Dawley rats.The two nerve ends shrank to form a 12-mm defect,and the nerve defect was repaired using a chitosan tube bridging autologous nerve segment (bridge group),a chitosan tube-encapsulated autologous nerve segment (encapsulation group),and a chitosan tube alone (chitosan tube alone group),respectively.MAIN OUTCOME MEASURES:Histological and ultrastructural changes of the injured sciatic nerve;number of regenerated myelinated nerve fibers; nerve conduction velocity; leg muscle atrophy; and sciatic nerve functional index.RESULTS:At 4 months after implantation,the chitosan tube was absorbed.The tube was thin,but maintained the original shape,and vascular proliferation was observed around the tube.In the bridge group,regenerative myelinated nerve fibers were thick and orderly,with a thick myelin sheath and intact axonal structure.The number of myelinated nerve fibers and nerve conduction velocity were significantly greater compared with the other groups (P< 0.01).Moreover,nerve and muscle function was significantly improved following chitosan tube bridging autologous nerve segment treatment compared with the other groups (P< 0.05 or P < 0.01).CONCLUSION:Chitosan tube bridging autologous nerve segments exhibited better repair effects on nerve defects compared with chitosan tubeencapsulated autologous nerve segments and a chitosan tube alone.This method provided a simple and effective treatment for long-segmental nerve defects.     

硫酸软骨素酶ABC(ch ABC)对大鼠坐骨神经损伤后神经再生功能的实验研究

目的观察硫酸软骨素酶ABC(chABC)对坐骨神经再生功能的影响。方法将72只SD大白鼠双侧坐骨神经切断造成0.8 cm缺损,用甲壳素导管桥接神经缺损后随机分为3组,每组24只。A组(实验组):管内注入聚乳酸-聚乙醇酸—chABC缓释微球(chABC-PLGA);B组(赋形剂组):管内注入聚乳酸-聚乙醇酸微球;C组(空白对照组):管内注入等渗盐水。术后4周、8周取材作神经电生理、神经组织学观察。结果术后4周、8周组织学观察见有再生神经通过再生室,其间有新生血管;神经电生理检查A组再生神经传导速度优于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05),B、C组再生神经传导速度差别无统计学意义,组间比较(P>0.0167)组间多重比较行Bonferroni法检验,取校正α=0.0167)。S-100免疫组织化学及Loyez氏神经染色法显示:A组神经纤维数多于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05),B、C组再生神经纤维数差别无统计学意义,组间比较(P>0.0167)。结论硫酸软骨素酶ABC(chABC)具有促进周围神经再生的作用。     

Biomimetic chitosan scaffolds with long-term controlled release of nerve growth factor repairs 20-mm-long sciatic nerve defects in rats

Although autogenous nerve transplantation is the gold standard for treating peripheral nerve defects of considerable length,it still has some shortcomings,such as insufficient donors and secondary injury.Composite chitosan scaffolds loaded with controlled release of nerve growth factor can promote neuronal survival and axonal regeneration after short-segment sciatic nerve defects.However,the effects on extended nerve defects remain poorly understood.In this study,we used chitosan scaffolds loaded with nerve growth factor for 8 weeks to repair long-segment(20 mm)sciatic nerve defects in adult rats.The results showed that treatment markedly promoted the recovery of motor and sensory functions.The regenerated sciatic nerve not only reconnected with neurons but neural circuits with the central nervous system were also reconstructed.In addition,the regenerated sciatic nerve reconnected the motor endplate with the target muscle.Therefore,this novel biomimetic scaffold can promote the regeneration of extended sciatic nerve defects and reconstruct functional circuits.This provides a promising method for the clinical treatment of extended peripheral nerve injury.This study was approved by the Animal Ethics Committee of Capital Medical University,China(approval No.AEEI-2017-033)on March 21,2017.     

Nanofibrous nerve conduits for repair of 30-mm-long sciatic nerve defects*

It has been confirmed that nanofibrous poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) nerve conduit can promote peripheral nerve regeneration in rats. However, its efficiency in repair of over 30-mm-long sciatic nerve defects needs to be assessed. In this study, we used a nanofibrous poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) nerve conduit to bridge a 30-mm-long gap in the rat sciatic nerve. At 4 months after nerve conduit implantation, regenerated nerves were macroscopically observed and histologically assessed. In the nanofibrous graft, the rat sciatic nerve trunk had been reconstructed by restoration of nerve continuity and formation of myelinated nerve fiber. There were Schwann cells and glial cells in the regenerated nerves. Masson’s trichrome staining showed that there were no pathological changes in the size and structure of gastrocnemius muscle cells on the operated side of rats. These findings suggest that nanofibrous poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) nerve conduit is suitable for repair of long-segment sciatic nerve defects.     

改性壳聚糖防粘连膜修复坐骨神经损伤

背景：研究表明壳聚糖与动物及人体具有较好的生物相容性、可降解性,可支持许旺细胞在壳聚糖膜上生长,而且能够明显抑制成纤维细胞生长。 目的：观察改性壳聚糖防粘连膜对大鼠坐骨神经再生修复的影响。 方法：切断60只SD大鼠双侧坐骨神经,缝合外膜,随机在一侧坐骨神经缝合处包裹改性壳聚糖防粘连膜,以另一侧为对照。术后20,30,40 d 进行电生理及组织学检测,观察改性壳聚糖防粘连膜对大鼠坐骨神经损伤修复的影响。 结果与结论：早期改性壳聚糖防粘连膜治疗侧神经断端的炎性反应较对照侧明显,随着膜的自行降解,炎症反应逐渐减轻,神经缝合口纤维组织增生减少。与对照侧相比,大鼠坐骨神经损伤30 d后,改性壳聚糖防粘连膜治疗侧神经传导速度恢复快,比目鱼肌记录到的神经-肌肉电潜伏期缩短(P < 0.05)。30 d后各时点与对照侧比较,改性壳聚糖防粘连膜治疗侧坐骨神经再生轴索密度大于对照侧(P < 0.05)。说明改性壳聚糖防粘连膜虽早期会加重周围神经损伤的炎性反应,但随着膜的降解,炎症反应逐渐减轻,可减轻神经缝合口纤维组织增生,防止粘连,因而有利于神经传导速度恢复及轴索生长。     

NGF促再生周围神经中血管生成及其机制研究

目的:探讨再生周围神经中NGF促血管生成及其有关机制。方法:用单通道的硅胶管硅胶45只Wistar大鼠1cm的坐骨神经缺损,在硅胶管内给药,并将它们随机分为四组:生理盐水组、几丁糖组(医用几丁糖简称几丁糖,此组15只,其中5只用作透射电镜观察),NGF+几丁糖组,NGF+几丁糖+抗VEGF组,每组10只,在术后14天时,用免疫组化的方法检测大鼠再生坐骨神经新生血管内皮细胞中CD34、vWf、VEGF、trkA的表达,并作半定量分析。同时用激光共聚焦扫描显微镜检测其表达情况。结果:生理盐水组、几丁糖组再生坐骨神经中的血管内皮细胞能表达TrkA、CD34、vWf、VEGF,两组间比较没有显著性差异,NGF+几丁糖组上述四抗原的表达比生理盐水组、几丁糖组有明显增加(P<0.01或P<0.05),NGF+几丁糖+抗VEGF组再生坐骨神经血管中的CD34和VEGF的表达完全被抑制,vWf、TrkA的表达与NGF+几丁糖组相比也显著减少(P<0.01)。激光共聚焦扫描发现,再生坐骨神经的血管中VEGF与CD34其表达明显而强烈,凡CD34表达阳性的,VEGF也表达阳性,VEGF的阳性表达比CD34要多。VEGF与vWf也呈明显其表达。结论:NGF能促进再生周围神经的血管生成;NGF促再生周围神经血管生成过程中,VEGF起着重要的作用,trkA、CD34也与之相关;NGF经trkA-VEGF-CD34通路来促进周围神经中毛细血管的生成;NGF促较大管径血管生成时,除经trkA-VEGF通路外,还可能存在其它途径。     

Immunological rejection of acellular heterogeneous nerve transplant for bridging the sciatic nerve in rats

BACKGROUND:Artificial materials composed of acellular heterogeneous nerves can resolve donor shortage problems for the repair of peripheral nerve defects.However,it remains unclear whether artificial materials can overcome immunological rejection of heterogeneous nerve grafts and obtain similar effects as allogeneic nerve grafts.OBJECTIVE:To analyze regeneration and immunological rejection of defective sciatic nerves in rats through the use of acellular heterogeneous nerve grafts.DESIGN,TIME AND SETTING:A randomized,controlled study was performed at the Department of Anatomy,China Medical University and the Experimental Center,First Affiliated Hospital,China Medical University between January and December 2008.MATERIALS:TritonX-100 (Sigma,USA) and deoxycholate (Pierce,USA) were used.METHODS:Bilateral sciatic nerves were collected from adult rabbits and treated with TritonX-100 and sodium deoxycholate to prepare acellular sciatic nerves,which were used to bridge 1 -cm defective sciatic nerves in adult rats.MAIN OUTCOME MEASURES:The lymphocyte percentage in leukocytes was quantified following hemocyte staining.Neural regeneration and the recovery of motor end plates in the gastrocnemius muscle were observed under optical and electronic microscopy following toluidine blue staining,as well as acetylcholinesterase and succinate dehydrogenase histochemical staining.RESULTS:There was no significant difference in the lymphocyte percentage in leucocytes between transplanted and normal rats (P > 0.05).At 3 months after surgery,the rat toes on the operated side were separated and the rats could walk.In addition,the footplates exhibited an escape response when acupunctured.A large number of regenerated nerve fibers were observed in the transplant group,and acetylcholinesterase-positive motor end plates were visible in fibers of the gastrocnemius muscle.CONCLUSION:Acellular heterogeneous nerve transplants for the repair of defective sciatic nerves in rats promote neural regeneration without significant immunological rejection.