家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法分析家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因推导的氨基酸序列。方法用ProtParam Tool、CDD、ProtScal、sopma等软件对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、功能结构域及蛋白质二级结构等重要参数进行预测。结果家蝇天蚕素-人溶菌酶由187个氨基酸组成,预测相对分子质量为20 131.7,理论等电点(pI)为9.69,分子式为C862H1375N277O260S11;半衰期预测结果显示其利于基因工程表达。融合蛋白的氨基酸序列含有天蚕素家族和溶菌酶家族二者的保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。结论分析结果为家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因的原核表达及表达产物的生物学功能研究奠定了基础。     

重组甘精胰岛素的可溶性表达研究

目的：构建甘精胰岛素（ING）表达载体,提高ING在大肠杆菌中的可溶性表达。方法：在传统方法中ING的A、B链之间用C肽连接,本实验在ING的A、B链之间插入大肠杆菌硫氧还蛋白质（Trx）来替代C肽,进行ING的融合表达（ING-Trx）,并进一步使用多分子伴侣GroEL、GroES、触发因子进行共表达。结果：可溶性的ING—Trx融合蛋白约占该目的蛋白质总表达量的35％;多分子伴侣共表达后可溶性ING-Trx的产量提高到ING-Trx总蛋白的78％,初步纯化后其产量为4．5mg·L-1,是使用分子伴侣前的3倍。结论：用Trx代替c肽不影响A、B链的有效折叠,采用分子伴侣共表达可以显著提高目的蛋白的可溶性。     

家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

目的对家蝇幼虫天蚕素基因进行克隆和序列分析。方法根据Genbank公布的家蝇成虫天蚕素Cecropin基因序列设计一对引物，以家蝇幼虫cDNA库液为模板，PCR扩增该基因的编码区序列。结果家蝇幼虫天蚕素cDNA目的基因的长度为229bp，与成虫防御素基因一致性为96％；最大的ORF位于20bp～211bp，含192bp。编码63个氨基酸。结论初步预测了该基因编码蛋白的化学性质和二级结构，为该基因的重组表达研究打下基础。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

重组人干细胞因子双体分子融合蛋白的构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的：设计并构建重组人干细胞因子的双体分子(BiSCF)融合蛋白并在原核中表达，预测该新型BiSCF融合蛋白的分了结构特性。方法：采用分子克隆方法分别构建SCF单体分子与BiSCF的原核表达载体pET32／SCF和pET32／BiSCF，并在大肠杆菌中进行表达，表达产物以Western BLot加以鉴定：采用生物信息学方法，以DS Gene1．1和ProtScale软件对该融合蛋白的结构特征诸如二级结构、等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析。结果：首次成功构建BiSCF双体分子pET32／BiSCF的原核表达载体，并经NcoⅠ和NotⅠ双酶切电泳及测序证实。通过转化origami^TM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得了高效表达，表达产量在40％以上：Western Blot显示表达产物能与抗SCF多克隆抗体特异性结合。对BiSCF双体分子融合蛋白的结构特性预测表明，BiSCF双体分子融合蛋白中的两个SCF单体分子其等电点、抗原性及亲水性均无显著改变，接头处具有高柔性。与SCF的原始序列相比，BiSCF的一级结构中有2个氨基酸发生了改变：二级结构中除插入的接头为无规卷曲外，原来的α螺旋和β片层均无改变。结论：本研究所构建表达的SCF单体和BiSCF双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达，BiSCF双体分子的结构预测符合我们的设计要求。为进一步深入研究新型BiSCF双体分子融合蛋白的生物学特性奠定了基础。     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a( )中,构建重组质粒pET32a( )-hBTC。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖。结论人成熟BTC蛋白在pET32a( )表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用。     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

人解痉多肽原核表达载体的构建及诱导表达

目的:构建人解痉多肽(hSP)原核表达载体,表达重组hSP,为功能研究奠定基础。方法:通过RT-PCR获得hSPcDNA片段,将目的基因插入原核表达载体pET32a,得到重组载体pET32a-hSP。IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析及WesternBlot检测。结果:经测序及PCR证实,hSPcDNA准确插入原核表达载体pET32a中,诱导表达后SDS-PAGE分析证明hSP的分子量约为32kD,Western-blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:上述结果表明成功构建出原核表达载体pET32a-hSP,获得重组hSP,并为深入研究hSP奠定了基础。     

家蝇抗菌肽Cecropin对人源性肿瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的分析家蝇抗菌肽Cecropin对人源性肿瘤细胞体外生长增殖与凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）MTT比色法测定家蝇抗菌肽Cecropin对人肺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MCF-7、人宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株BEL-7402和人正常肝细胞株Changs,Liver生长增殖情况的影响,采用流式细胞术检测家蝇抗菌肽Cecropin作用后4株肿瘤细胞凋亡的情况,对照组不加家蝇抗菌肽Cecropin。结果家蝇抗菌肽Cecropin对4株人源性肿瘤细胞的生长均有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞发生凋亡,但对人肝癌细胞BEL-7402作用效果相对较强。结论家蝇抗菌肽Cecropin能够影响人源性肿瘤细胞的生长与凋亡,作用机制需进一步研究。     

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的 构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性.通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21 (DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白.用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.结果 测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒.SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带.结论 本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物Ad-TIMPL-1基因克隆及其原核表达

目的克隆十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物(TIMPL)Ad-TIMPL-1基因并进行原核表达。方法分别用3’RACE及RT-PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增编码Ad-TIMPL-1的cDNA3’末端及5’末端序列;序列经拼接后进行初步生物信息学分析;将Ad-TIMPL-1成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒;重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆获得了编码Ad-TIMPL-1的全长cDNA序列并登记到GenBank(accession no.EF495071);Ad-TIMPL-1完整阅读框为396bp,编码132个氨基酸残基组成的蛋白,含16个氨基酸残基组成的信号肽;成功构建了原核表达重组质粒pET-32a/Ad-TIMPL-1,并在大肠杆菌中得到了表达。结论本研究首先从十二指肠钩虫中克隆到了Ad-TIMPL-1基因并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂的克隆与表达

目的 克隆并表达十二指肠钩虫天冬氨酸蛋白酶抑制剂（Aa—API-1）。方法根据犬钩虫及锡兰钩虫API保守序列设计引物,RT—PCR扩增获得Ad—API-1完整阅读框序列,并将Ad—API—1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,以构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌B121（DE3）中用IPTG诱导表达,用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得Ad—API-1完整阅读框序列;构建了pET32a／Ad—API-1重组质粒,Ad—API—1在大肠杆菌中得到了高效表达。结论成功克隆并表达Ad—API—1,为进一步研究Ad—API-1的功能,探讨其作为血清学诊断抗原或保护性疫苗奠定了基础。     

巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较

目的：探讨巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP的生物学特性及应用的可能性。方法：构建了hmGFP的两个原核表达载体并进行诱导表达。结果：低温下hmGFP获得了功能性表达而发光。深入比较了重组巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP在两个表达体系中的表达差异，其中pETTFRX-hmGFP的重组蛋白表达水平和可溶性均比pET21b—hmGFP高。结论：对pETTFRX—hmGFP的表达条件进行了优化，为下一步hmGFP成熟重组蛋白的纯化及其荧光波谱分析奠定了良好基础。